系统性红斑狼疮患者Fas和CD40L表达的初步研究(2)

　　系统性红斑狼疮(SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，引起多器官损害，具有产生多种自身抗体的特点[1]。Fas和CD40L均属于TNF/NGF受体超家族成员。Fas是一种细胞凋亡的调节蛋白受体，通过与Fas配体结合，介导细胞凋亡[2]。CD40L是表达于B细胞或其他抗原递呈细胞(APC)表面的CD40分子的配体，目前认为，共刺激分子CD40-CD40L是为激活淋巴细胞的第二信号系统的组成部分，其在T细胞介导的B细胞活化中具有重要作用[3-4]。本研究同时检测SLE患者血清sFas和sCD40L水平及外周血CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L和Fas的表达，并用抗FasL抗体、抗CD40L抗体分别阻断Fas信号和CD40信号测定CD4(+)和CD8(+) T细胞表面CD40L和Fas的表达，观察了淋巴细胞表面Fas与CD40L表达的相关性及相互之间是否存在表达的调控情况，从而探讨Fas和CD40L参与SLE发病过程的可能尚未被认识的机制。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象和分组 ①SLE组：南京医科大学附属苏州市立医院门诊或住院的SLE患者46例，其中女性42例，男性4例，年龄9～61岁，平均年龄32岁。其中36例进行血清sFas、sCD40L测定,10例进行T细胞亚群表面Fas与CD40L表达及相关性研究。所有SLE病例均符合美国风湿病协会(ARA)的诊断标准。根据临床表现及实验室检查指标，参照SLE疾病活动性指数(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)[5]评分标准，判断SLE的病情活动性，将SLE组患者进一步分为活动期(SLEDAI≥ 10)及缓解期(SLEDAI<10)2个亚组。②正常对照组:30例，其中男3例，女27例，平均年龄32.5岁，均为门诊健康体检者。

　　1.2 主要仪器 MicroReader4型酶联免疫检测仪,HFsafe-900型生物安全柜;TC2323型二氧化碳培养箱,Coulter公司流式细胞仪。

　　1.3 主要试剂 晶美生物工程有限公司sFas检测试剂盒,Bender MedSystems公司sCD40L检测试剂盒,上海试剂二厂淋巴细胞分离液,GIBCO公司RPMI 1640培养液,eBioscience公司抗人FasL、抗人CD40L阻断性抗体,Caltag公司PE-CY5-抗CD3、FITC-抗CD4、FITC-抗CD8荧光标记抗体,eBioscience公司PE-抗CD40L、PE-抗Fas荧光标记抗体。

　　1.3 方法

　　1.3.1 sFas、sCD40L的检测 严格按说明书进行操作。结果判断：用MicroReader4酶标仪比色，得到光密度(D)值，以标准品浓度作横坐标，D值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的D值可在标准曲线上查出其浓度。

　　1.3.2 细胞分离培养 取正常健康体检者和SLE患者肝素抗凝外周静脉血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用RPMI 1640培养液调细胞密度至1×109/L，加入24孔培养板中37℃、5% CO2培养48 h。SLE患者细胞培养液中纯化抗人FasL抗体和纯化抗人CD40L抗体浓度均为1 mg/L。正常对照组细胞培养液中植物血凝素(PHA)浓度为75 mg/L。

　　1.3.3 流式细胞仪检测 取100 μl细胞悬液，分别加入抗CD3、抗CD4、抗CD8单抗各5 μl，加入抗Fas抗体或抗CD40L抗体20 μl，在对照管中加入正常小鼠IgG1(κ独特型)20 μl，混匀后置室温20 min，用PBS洗1次，弃上清液加入生理盐水0.5 ml后进行流式细胞计数分析。

　　1.4 统计学处理 数据采用±s表示，样本均数比较采用t检验。相关性检验采用Spearman等级资料进行分析，P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 SLE患者与正常对照组血清sFas、sCD40L检测结果比较 SLE患者血清sFas、sCD40L水平均明显高于正常对照组(P均<0.01)，SLE患者血清sFas、sCD40L水平活动期均高于缓解期(P<0.01或P<0.05)。见表1。

　　2.2 SLE患者血清sFas、sCD40L水平与SLEDAI积分的相关性分析及sFas、sCD40L水平之间的相关性分析 sFas、sCD40L与SLEDAI积分之间均存在正相关关系(r=0.688、r=0.253，P均<0.05)，sFas与sCD40L水平之间未显示明显相关(r=0.201，