抗肿瘤药氯法拉滨的致突变性及溶血性研究(2)

　　2.2.1 CLO试验组 选用健康雄性昆明种小鼠30只，以CLO 20mg/kg灌胃给药7天后，处死小鼠、摘除附睾，用生理盐水将血液漂洗干净，置小烧杯中，用剪刀将附睾纵向剪开，加生理盐水1～1.5ml，用滴管反复适度吹打，使精子均匀散在液体中，静置1min。取上层悬液1滴，加在干净的载玻片上，盖上盖片，立即用高倍镜观察，检查精子的头部、体部和尾部的形态变化。以形态良好，游动活泼的精子为正常。以无头、小头、胖头、双头、双尾、无尾及无定形为精子畸形[3，5]，计数1000个精子的畸变率。

　　2.2.2 阳性对照试验 取雄性小鼠10只，腹腔注射环磷酰胺40mg/kg[5]，相当于体积剂量为0.4ml/(25g·d)，连续5天，取精子方法、计数精子畸变率法同试验组。

　　2.2.3 阴性对照 取雄性小鼠10只，以0.4ml/(25g·d)的剂量做腹腔注射生理盐水，连续7天，用药时间、取精子方法、计数畸变率同试验组。

　　2.3 溶血性试验 CLO测试物溶液以1mg/ml为原液进行稀释。

　　2.3.1 试管设定 分设阳性对照、阴性对照试管各1支，测试管1～5号，共7支。

　　2.3.2 红细胞悬液的制备 无菌抽取健康志愿者O型血5ml，置50ml无菌锥形瓶中用玻璃珠摇晃去除纤维蛋白，然后分取1/2移入2支10ml刻度离心管中，各加入生理盐水5ml，混匀，离心1500rpm 10min，弃上清，洗2次。将所得红细胞用生理盐水稀释成2%，备用[6]。

　　2.3.3 加样 取试管7支，编号。按表1所示，分别加入各溶液。表1 溶血性试验加样表 (ml)

　　第6管不加CLO溶液，只加红细胞溶液及生理盐水作为阴性对照;第7管不加CLO溶液和生理盐水，只加红细胞溶液和蒸馏水作阳性对照。1～5管为测试管，加入不同体积的CLO溶液和不同体积的生理盐水，使其成为递减的终浓度。将各管置于试管架上轻轻摇匀，置37℃中进行恒温水浴4h，分不同时段观察各管的溶血和凝集现象，必要时用显微镜观察红细胞是否完整。显微镜观察方法：将试管轻轻摇匀，取溶液20μl，滴于载玻片上，盖上盖片，高倍镜观察细胞的有无及完整性。

　　3 实验结果

　　3.1 微核试验 小鼠骨髓片经Giemsa染色后进行阅片，选择细胞完整、分布均匀，着色适度的区域，用高倍镜观察[1]。镜下：嗜多染红细胞呈灰白色，因成熟红细胞核糖体消失，被染成淡桔红色，微核大多情况下呈单个圆形，边缘光滑整齐，游离于细胞质中，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5，故称为微核。CLO测试物与阳性对照、阴性对照的微核发生率及其对照如表2所示。表2 CLO微核率与阳性对照、阴性对照实验结果

　　注：*CLO测试组与阳性对照,阴性对照的比较结果 CLO测试物与阳性对照和阴性对照的关系分析：采用SPSS11.0统计软件进行分析，所得数据用均数±标准差(〖x〗±SD)表示。经分析表明，CLO测试组与阳性对照组两者之间差异无显著性(P>0.01)，CLO测试组与阴性对照比较差异有显著性(P<0.05)。因此推断，抗癌新药CLO对骨髓红细胞有一定的致突变作用。

　　3.2 精子畸变试验 高倍镜观察：每只小鼠计数1000个精子，分计出正常与异常精子。统计学处理：使用SPSS13.0软件对统计数据进行χ2检验，组间比较用χ2分割法。结果见表3。表3 CLO精子畸变与阳性对照、阴性对照实验结果及比较

　　结果表明：精子畸变试验中，CLO测试组与阳性对照组差异无显著性(P>0.05)，而与阴性对照组差异有显著性(P<0.01)。因此，CLO对雄性昆明种小鼠有诱导遗传突变、精子致畸作用。

　　3.3 溶血性试验 在37℃水浴中，每隔15min观察1次，4次后每隔1h观察1次，共7次，有疑问者取20μl做压片，显微镜观察。实验结果判定参见表4。根据以上标准，CLO溶血性试验结果见表5。表4 红细胞溶血、凝血判断标准表5 CLO溶血性试验结果

　　蒸馏水阳性对照管在15min观察，溶液红色透明，管底无红细胞沉淀，镜下无细胞，即为全部溶血。生理盐水阴性对照管和1～5号CLO测试管各时段均为上部无色透明，红细胞全部沉入管底，摇后红细胞分散，液体呈红色混浊。显微镜下观察形态，数量正常，表示不溶血。

　　4 讨论

　　4.1 CLO对小鼠骨髓嗜多染红细胞形成微核的效应 我们采用的小鼠微核试验是20世纪70年代初建立的一种利用哺乳动物骨髓细胞染色体改变来测定突变作用的实验方法。具有检测对骨髓细胞作用及染色体损伤效应的方便、快捷、可靠的特点。已被国际组织如国际经济合作和发展组织(OECD)、国际诱变剂、致癌剂防护委员会(ICPEMC)等推荐为检测致癌剂、诱变剂广泛应用的遗传毒理学方法之一[7～9]。因此，我们利用微核试验作为实验手段是可行的。微核的形成，起因于染色体断片或有丝分裂器紊乱，是由染色体断片或整条染色体在细胞分裂后期，不能移到细胞纺锤体两极而游离于细胞浆中而形成的。致断裂物质和纺锤体抑制剂都能导致微核的形成。CLO作为一种核苷酸类似物[8～10]，其经脱氧胞苷激酶磷酸化为三磷酸盐。首先能有效地抑制核苷酸还原酶，使DNA合成终止;同时也能抑制DNA聚合酶a ，使DNA链不再延长，形成染色体断片。CLO对不同的细胞株和肿瘤模型都表现出很强的抗癌活性，因此，具有较强的细胞毒性。有报道称[1]，在2mg/m2的浓度剂量下，干细胞中CLO的代谢产物三磷酸盐水平持续保持较高水平，此水平可持续抑制DNA的合成。目前，抗肿瘤药物的特点是治疗指数较小，选择性较差。在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞特别是增殖更新较快的正常组织如骨髓、胃肠黏膜上皮、淋巴组织、毛囊和生殖细胞等产生不同程度的损害[10]。因此，在骨髓红细胞的增殖过程中，