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研非复制性腺病毒携带AT2(2)

2014-05-02 01:30
　实验铺板 293 细胞，培养过夜后，按MOI=10 分别加入两个病毒，收上清用于抗体的检测实验。用双夹心ELISA 法测定抗体的表达量；用Western 鉴定其与商品化的Cetuximab 单抗比较分子量大小；间接免疫荧光实验是根据抗原抗体反应的原理，用荧光标记抗体作为分子探针，检查抗体Cetuximab 与A431 细胞膜上的抗原EGFR 结合的特异性，同时用EGFR 阴性的SK-Br-3 细胞做阴性对照。

　　2. 结果
　　腺病毒穿梭载体pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鉴定结果。

　　应用50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度，Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 的病毒滴度分别是1.2×1010pfu/ml，1.0×1010pfu/ml。

　　用双夹心 ELISA法测定病毒抗体的表达量：Ad-AT2 与Ad-NAT2 相比的表达量分别是：

　　25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通过修改密码子较大的提高了抗体的表达量。

　　重组腺病毒Ad-AT2、Ad339-NAT2 按MOI＝10 转染细胞株293，感染72 小时后用Western Blot 方法检测细胞上清中Cetuximab 抗体与商品化的抗体比较分子量大小。查看EFNB2与精神分裂症样本的关联。

　　3 讨论
　治疗各种疾病、顽症中有巨大的优势，但是由于其自身的某些性质，加上目前我们的生产抗体的技术和工艺，限制了抗体的应用。在当前的生产抗体的工艺比较复杂，需要综合多项技术，工艺和技术都被少数公司垄断，而且抗体的需要量也在增大，最后导致抗体的治疗成本极高。

　　为了降低成本和提高抗体治疗效果，基因治疗是一种新型有效的手段，我们可以通过把全长抗体基因装入载体，通过载体带进体内，是抗体在体内表达。这样既可以免去体外生产抗体众多复杂的过程，降低成本，又可以使抗体更好的在体内持续作用，更好的到达组织。

　　因此，如何找到一个安全的，有效的载体是关键。腺病毒成为一个重要的载体，由于我们对其研究得比较清楚，我们对其进行改造，删除负责病毒复制的E1A 区以及其它多余的区域。

　　腺病毒作为载体应用于基因治疗中有众多优点，在目前的条件下，腺病毒载体相对于其它载体，更适合作为基因治疗的载体。

　　根据密码子的偏爱性，我们收集了高表达的氨基酸密码子，修改了部分抗体基因的密码子，以此来提高抗体的表达量。经Western 鉴定和IFN 实验证明腺病毒载体表达的抗体是完整和有活性的，特异性也很好，可以应用下一步的治疗研究。