探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的
2014-04-29 01:30
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1 引言
人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起宫颈癌的主要病
1 引言
人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起宫颈癌的主要病因，HPV 相关抗原具有宫颈癌特异性，因此HPV 相关抗原能够有效预防人的HPV 感染，但是临床研究发现不能治疗HPV 感染、宫颈癌或癌前病变。笔者首次报道，聚肌胞(poly (I:C))联合E7(44-62)（属HPV 多肽，同时含MHCI 和II 类抗原）能产生特异性细胞毒性T 细胞反应且增加树突状细胞（DC）数量，完全抑制人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长，与MHC I 类抗原比较，含MHC I 和II 类抗原的多肽疫苗能够显著延长抗肿瘤免疫反应时间[1-3]。拟通过MTT 实验和流式细胞技术研究正常人、宫颈癌和癌前病变患者的外周血DC 在聚肌胞联合E7(44-62)刺激下的免疫反应，为其临床应用提供理论和实验依据。
2 材料和方法
2.1 检测对象及分组
（1）宫颈癌组： 10 例。为湖南省肿瘤医院收治的宫颈癌患者，女，年龄41～62（平均51.5）岁。所有宫颈癌均经病检证实，凡接受放、化疗或免疫调节治疗患者均排除在外。术前1 周内清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。
（2）CIN 组： 10 例。均为宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ期患者，所有宫颈上皮内瘤变经病检证实。女，年龄39～54（平均46.2）岁。术前1 周内清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。
（3）正常对照组： 10 例。女，年龄28～35 岁（平均34.2）岁，均为在校的健康志愿学生，清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。
2.2 检查项目及方法
2.2.1 DC 的分离和培养
方法见参照文献[4]，以Ficoll 密度梯度离心方法从外周血中分离单个核细胞，在无菌条件下将所获细胞加入含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液（美国GBICO 公司产品）中培养（37℃、5%CO 2）。1h 后，轻洗培养瓶去除非贴壁细胞，贴壁细胞加入含重组人白细胞介素-4(500U/mL)和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（500U/mL）的RPMI 1640 培养液中继续培养7d，2～3d 更换培养液1 次。
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2.2.2 MTT 实验
加入0.25% Trypsin-EDTA Solution 消化后，用RPMI 1640 培养液制成DC 细胞悬液，台盼蓝拒染法鉴定细胞存活率> 95%。各组细胞（1×105/ml，总体积100 μl）在RPMI 1640完全培养液中与含聚肌胞（终浓度为50μg/ mL，购自英国GE Healthcare 公司），或聚肌胞（终浓度为50μg/mL）和E7(44-62)（终浓度为100μg/mL，序列为QAEPDRAHYNIVTFCCKCD，由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成）或培养液（空白对照）共同培养。5 d 后，加入MTT(10 μl，5mg/ml)并于37 ℃ 孵育4 h，采用酶标仪检测490nm 波长吸光度值。DC细胞增殖比例＝实验组吸光度/ 空白对照吸光度。
2.2.3 流式细胞技术
将分离的DC移入RPMI 1640 培养液内含聚肌胞，或聚肌胞和E7(44-62)（ 终浓度均同前），或培养液共同培养16 h。根据固定/渗透试剂盒（购自英国BD 公司）说明进行细胞内双染色，流式细胞仪检测异硫氰酸（FITC）标记鼠抗人CD11c 单克隆抗体和藻红蛋白（PE）标记鼠抗人CD86 单克隆抗体（抗体均购自美国eBioscience 公司）标记的细胞。阳性细胞百分率（%）＝染色阳性细胞数／总细胞数×100％。
2.3 统计分析
计量资料用±S 表示，组间差异采用ANOVA 及q 检验分析。P <0.05 认为
统计学上有显著意义，统计学处理采用SPSS 13.0 软件。
3 结果
3.1 DC 的比例及增殖反应
宫颈癌组外周血的DC 占外周血单核细胞的比例（0.12+0.007，%）显著低于C 组（1.13+0.056，%）和CIN 组（0.25+0.012，%）（均P <0.01）；CIN 组DC 的比例显著高于宫颈癌组（P <0.05）。与聚肌胞比较，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著提高C 组、CIN组和宫颈癌患者外周血的DC 的增殖反应（均P <0.01）。宫颈癌组和CIN 组DC 对聚肌胞联合E7(44-62)刺激的增殖反应显著低于C 组（均P <0.01），宫颈癌组DC 的增殖反应与CIN组无显著差异（P >0.05），图1。
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3.2 DC 的CD11c+/CD86+表达
宫颈癌组DC 的CD11c+/CD86+的表达水平显著低于C 组和CIN 组（P <0.01，P <0.05），C 组CD11c+/CD86+的表达水平显著高于CIN 组（P <0.05）。 与聚肌胞组比较，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著提高宫颈癌患者外周血的DCCD11c+/CD86+的表达水平（P 值分别<0.01，<0.05），图2。
DC 的CD11c+/CD86+表达 A：C 组DC 在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；B：C 组DC 在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；C：C 组DC 在加入聚肌胞联合E7(44-62)后CD11c+/CD86+的表达；D：CIN 组DC 在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；E：CIN 组DC 在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；F：CIN 组DC 在加入聚肌胞联合E7(44-62)后
