探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的(2)
2014-04-29 01:30
导读：CD11c+/CD86+的表达；G：宫颈癌组DC 在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；H：宫颈癌组DC 在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；I：宫颈癌组DC 在加入聚肌胞联合E7(44
CD11c+/CD86+的表达；G：宫颈癌组DC 在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；H：宫颈癌组DC 在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；I：宫颈癌组DC 在加入聚肌胞联合E7(44-62)后CD11c+/CD86+的表达。宫颈癌组DC 的CD11c+/CD86+的表达水平显著低于C 组和CIN 组（P<0.01，P<0.05），C 组CD11c+/CD86+的表达水平显著高于CIN 组（P<0.05）。与聚肌胞组比较，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著提高宫颈癌患者外周血的DC 的CD11c+/CD86+表达水平(P 值分别<0.01，<0.05)。
4 讨论
E7 基因是引起宫颈上皮细胞恶变最重要的癌基因之一，所编码的E7 蛋白是宫颈癌特异性抗原。因此，E7 蛋白适于作为宫颈癌疫苗的抗原物质[5]，但单独免疫后往往无法产生有效的抗宫颈癌免疫应答，其较弱的免疫原性及主要组织相容性抗原（MHC）限制性（即必须与MHC 类分子结合后才能被具有相同MHC 表型的免疫细胞所识别）是抑瘤失败的主要原因[6,7]。
聚肌胞是一种人工合成的双链RNA，和来源于病毒感染的双链RNA 具有类似的抗病毒和抗肿瘤功能。聚肌胞是Toll 样受体3 的配体，Toll 样受体3 在人和动物髓样DC、T 细胞、纤维原细胞内同时表达，聚肌胞与Toll 样受体3 结合能够诱导大量的IFN-α和IFN-β[8]，后者具有广谱抗病毒作用。聚肌胞增强CD8+ T 细胞的功能，而且通过抑制凋亡延长CD8+ T细胞的存活；还能够增加活化CD4+ T 细胞的存活率；源自黑色素瘤特异性抗原的MHCⅠ类多肽和聚肌胞联合免疫小鼠后，能够明显增加抗原特异性CD8+ T 细胞的数量和IFN-γ、TNF-a 的释放，并且还抑制黑色素瘤细胞的生长[9,10]。聚肌胞能够增强免疫反应性、促进具有MHCI、II 类表型T 细胞的存活/功能以及促进DC 成熟和增加抗原呈递能力的特性[11]。
笔者[1]研究含有全部抗原决定簇的肿瘤细胞裂解体联合poly(I:C)免疫的抑瘤作用，采用联合注射poly (I:C)和TC-1 细胞裂解体（TC-1 细胞是转染 E6、E7 基因和活化H-ras 基因的C57BL/6 小鼠肺上皮细胞）的方法，能够明显延缓人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长；另一种方案先将poly(I:C)转染TC-1 细胞，裂解已转染的TC-1 细胞后注射入人宫颈癌模型小鼠皮下，结果发现比联合注射poly (I:C)和TC-1 细胞裂解体有更强的CD8+ 细胞毒性T 淋巴细胞反应和抗肿瘤作用。笔者[2]证实人宫颈癌模型小鼠DC 较正常小鼠数量明显减少和功能缺陷，而E7（49-57）和poly (I:C)的联合免疫能够增加负瘤小鼠DC 数量和改善功能。此外还发现，poly(I:C)联合E7（49-57）(含MHCⅠ类限制性多肽) 通过诱导强烈的E7（49-57）特异性CD8+ 细胞毒性T 淋巴细胞反应，能够完全的抑制人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长，而单独注射E7（49-57）无法抑制肿瘤生长。近期，笔者[3]报道了E7(44-62)(同时含MHCⅠ和Ⅱ类限制性多肽)+poly(I:C)联合免疫的短期（免疫后20 天）和长期（免疫后50 天）抑瘤反应的研究结果，发现MHCⅠ类限制性多肽联合poly(I:C)免疫只能产生短期的CD8+ 细胞毒性T 淋巴细胞反应和抑瘤反应；而E7(44-62) +poly(I:C)能同时产生CD4+ 辅助T 淋巴细胞反应、CD8+ 细胞毒性T 淋巴细胞反应和长期有效的抑瘤反应，并证实CD4+ 辅助T 淋巴细胞反应联合CD8+ 细胞毒性T 淋巴细胞反应是维持长期有效抑瘤免疫的关键。
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DC 是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，数量极少，仅占外周血单核细胞的1％以下，能有效地激发静息的T 细胞活化和增殖反应，很少量的DC 就能够启动快速、强大的免疫反应。本研究中，宫颈癌患者DC 的比例明显减少，而且增殖反应明显减弱，提示宫颈癌患者不仅存在DC 数量的减少，而且DC 的增殖功能也发生障碍。CD 11c 和CD 86 分别是活化DC表达的粘附分子和协同刺激分子，同时表达（CD11c+/CD86+）是成熟DC 的特异性标志，具备高效的抗原递呈功能。宫颈癌患者DC 的比例明显减少、增殖和活化出现明显缺陷，推测宫颈癌通过使体内DC 数量下降，增殖障碍，成熟受限，从而下调或抑制DC 的抗原提呈及免疫启动和维持功能导致肿瘤免疫逃逸的发生。现已证实，肿瘤不但干扰DC 发育的多个环节，还可以直接诱导DC 凋亡， 导致数量减少。Akt 是“ 细胞生存通路PI3K（phosphatidylinositide-3'-OH kinase ，PI3K）/Akt”关键分子，活化的Akt 能够磷酸化下游多个凋亡相关底物如Bcl-2 家族、凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族、Foxo 家族、Caspase-3、Caspase-9 等，通过上述调控机制发挥强大的抑制凋亡作用。Pirtskhalaishvili 等[12]将小鼠DC 与前列腺癌细胞株共同培养48 小时，导致DC 凋亡明显增加达53.66 ％，而对照组只有17.71 ％；通过Bcl-xL 转染DC 或IL-12 刺激方式，DC 表达Bcl-xL 增加，后者阻断肿瘤的促DC 凋亡作用，使DC 数量增加并产生明显的抑瘤效果，同时发现Fas/FasL 通路与DC 凋亡无关。Caspase 家族蛋白酶位于PI3K/Akt 通路的下游，诱导凋亡时需要解除IAP 对Caspase 的抑制作用，其中Caspase-3 与DC 凋亡的关系最直接和密切，是诱导凋亡的重要因子。通过研究胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG DNA）抑制小鼠DC 凋亡的机制，发现Bcl-2 和Bcl-xL 表达的高低不影响DC 凋亡的水平，说明Bcl-2 和Bcl-xL 不是调控DC 凋亡的主要因子；CpG DNA 通过上调PI3K 依赖性凋亡抑制蛋白cIAP 1（cellular inhibitor of apoptosis proteins ，cIAPs）的表达和下调Caspase-3，从而抑制DC 的凋亡和增加DC 的数量，认为PI3K/Akt 是抑制DC 凋亡的重要途径[13]。本研究发现，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著改善DC 增殖功能、增加细胞数量、提高其CD11c+/CD86+表达，提示聚肌胞联合E7(44-62)能够改善DC 的免疫功能，为启动和维持的抗肿瘤免疫应答提供必要的条件。
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宫颈癌患者全身免疫功能低下时，常表现为外周血中DC 功能、构成上的缺陷，因此通过对外周血DC 免疫功能的检测能够评估患者的免疫状态。在前期工作的基础上将研究对象从动物过渡到人，研究聚肌胞联合E7(44-62)对外周血DC 的免疫增强作用，为疫苗的临床应用提供理论和实验依据。
