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研究凋亡素参与正常细胞核蛋白表达差异(2)

2014-05-03 01:03 g，离心20 s (室温)。仔细弃全部上清，加蛋白酶抑制剂2μl，缓冲液B 400μl，混悬，冰浴1h，间以搅拌。超声去核酸，工作时间2s，间歇时间10s，功率200w。4℃，14 000 g，1h，吸取上清，分装。用Bradford 法测蛋白浓度。

　　2.7 细胞核蛋白的双向电泳将提好的细胞核蛋白样品分装，送公司进行双向电泳。

　　3．实验及结果分析
3.1 激光共聚焦检测凋亡素定位结果激光共聚焦荧光显微镜观察凋亡素转染24 及48 小时后，在肿瘤细胞与正常细胞的定位情况。转染24 小时后，凋亡素定位在肿瘤细胞和正常细胞的细胞核，无明显的凋亡形态特征变化。转染48 小时后，凋亡素从正常细胞核内出来在胞质中聚集，无凋亡形态特征变化；而仍定位于肿瘤细胞的核内，聚集，可以见到细胞核的染色质高度凝聚，细胞核裂解为碎块，边缘不清晰，产生凋亡小体，引起肿瘤细胞的特异凋亡。

　　3.2 双向电泳结果我们通过双向电泳进行初步分析，发现HepG2 与L02 细胞核蛋白表达存在差异。

　　4．讨论凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非P53 依赖的，而不能够导致正常细胞的凋亡。同时我们观察到，凋亡素在细胞内的定位与其凋亡功能密切相关。将凋亡素的基因转染进细胞，24 小时后，我们发现凋亡素无论在肿瘤细胞还是正常细胞，都定位在细胞核内，都不引起细胞的凋亡。48 小时后，凋亡素在肿瘤细胞核内聚集，行使凋亡功能，而凋亡素却从正常细胞的核内出来，在胞质内聚集，不能引起正常细胞的凋亡。于是我们推测，凋亡素行使凋亡功能与其在肿瘤细胞核内受到某种修饰，而停留在细胞核内有关。而这种修饰在正常细胞的核内是没有的，因此肿瘤细胞与正常细胞之间一定存在着某种蛋白表达的差异。

　　凋亡素包含两个分开的核定位信号（位置82-88，111-121），和一个CRM1 调节的核输出信号。有文献报道，当凋亡素进入肿瘤细胞核内后，其108 位的苏氨酸被磷酸化，抑制了CRM1 的活性，影响了凋亡素在肿瘤细胞内的核输出。而凋亡素在正常细胞内不被磷酸化，核输出信号依赖CRM1 使凋亡素从核内输出，在胞质内聚集成大的聚合体，而最终被其他蛋白所中和，丧失了诱导细胞凋亡的功能。

　　因此，我们可以推测在肿瘤细胞内存在着特异的磷酸激酶，或者其他某种能使凋亡素特异修饰的蛋白。

　　目前高通量的蛋白质组学研究方法已经成为了有力的手段，蛋白质质谱鉴定技术和生物信息学迅猛发展。高分辨率、高敏感性和高流通性的分离和分离后鉴定技术，结合准确、全面的数据库技术，使蛋白质组技术用于生物研究卓有成效。我们通过蛋白质组学的方法找到了肿瘤细胞HepG2 细胞和正常细胞L02 细胞核蛋白表达的差异，但是由于时间关系，没有对差异点进行质谱分析，鉴定，这是我们下一步的工作，以期望能够找到这个特异的蛋白，来完善凋亡素的机制研究。