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简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新

2014-06-11 01:59 毕业

作者：肖琼　房云海　徐蕴　田铧　张立平　田兴松
【摘要】  目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50 mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养6～8 d 时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14 d 时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80%的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。
【关键词】  主动脉·体外培养·内皮细胞·大鼠
   A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
     【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat,  of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6 to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
    　　内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最常用的工具。目前，对脐静脉等较大血管原代内皮细胞的分离与培养1般采用酶消化法，技术已经成熟。但对于大鼠等小动物血管而言，由于管径细小，操作难度大，其内皮细胞的分离与培养1直存在产量少、易混入杂细胞等问题 ［1］。本研究经过反复实验，建立了1种有效获取高纯度、高数量大鼠原代血管内皮细胞的分离与培养方法。 （科教范文网 fw.nseac.com编辑发布）
    1　材料与方法
    1.1　实验材料　4周龄Wistar 大鼠10只，均为雌性，体质量140～160 g（购自山东大学动物实验中心），缝衣针，手术缝合线，胎牛血清（HyClone，购自美国），DMEM/F12培养基（Gibco，购自美国）。
    1.2　培养方法
    1.2.1　大鼠主动脉的原代培养　取Wistar 大鼠1只，无菌条件下打开腹腔和胸腔。截取主动脉约3 cm,放入含有青霉素105 U/L、链霉素100 mg/L的D-Hanks液中，用吸管将动脉管腔残留的血液冲洗干净。缝衣针去尖,牵引手术缝合线穿过主动脉管腔，缝合线的远端就近结扎动脉的1端，血管钳牵引缝合线近端，同时用镊子轻轻反向下滑动脉，使主动脉内膜翻出，折入缝扎动脉的另1端，此时翻过来的动脉两端被完全折入封闭。将动脉置于50 mL培养瓶中，加入含有20%胎牛血清的培养液，液体仅遮盖主动脉即可，置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养，3 d 换液1次。
    1.2.２　细胞传代培养　原代培养约12 ～14 d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，约80 %的细胞汇合即可传代。取出主动脉，用D-Hanks液冲洗培养瓶2次，常规消化、吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液适量，制成细胞悬液，依照细胞的量按1：1或1：2传代培养，3 d换液1次。另9只大鼠以同样步骤重复上述实验。
    1.3　免疫细胞化学鉴定　在24孔培养板内放置无菌盖玻片，每孔种植1 mL 含有104个细胞的悬液，待细胞生长至接近汇合时,取出盖玻片，室温下4%的多聚甲醛固定10 min,常规SABC法显示血管内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原（vWF）。
    1.4　细胞纯度分析　取6次培养的第2代主动脉内皮细胞，vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，计算细胞阳性表达率（细胞阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数）。 （科教论文网 lw.nSeAc.com编辑发布）
    2　结果
    2.1　形态学　原代培养6～8 d，在动脉附近可见少量的细胞迁出并贴壁生长，细胞呈短梭形或多角形。培养至12 ～14 d，迁移出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，密度不匀，其中约80 %的细胞汇合成单层，呈现内皮细胞典型的“鹅卵石”样特征（图1）。传代培养的细胞0.5 h开始贴壁，2 h后约90 %的细胞贴壁，4 ～5 d时细胞汇合成单层。培养至9代时，细胞质内有空泡出现，同时出现胞体瘦小，细胞呈现老化状态。
    2.2　免疫细胞化学染色　vWF免疫细胞化学染色，细胞质呈现棕黄色阳性反应。每张盖玻片100倍镜下随机选10个视野进行观察，均未见染色阴性表达细胞（图2）。
    2.3　细胞纯度分析　vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，所见细胞均为阳性染色细胞，阳性表达率为100%，即获取的内皮细胞纯度为100%。
    　　重复实验10次，均获得同样结果。

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3　讨论
    　　血管内皮细胞的原代分离与培养是研究其分子生物学特性及相关疾病的重要前提，大鼠是最常用的实验动物之1。长期以来，由于大鼠血管细小，操作难度大，其血管内皮细胞的分离与培养尚缺乏理想的手段。鼠主动脉内皮细胞多采用酶消化法［2-3］和植块法［4－6］。
    　　酶消化法可以在相对短的时间内获取细胞。大鼠主动脉较细，本实验发现150 g的大鼠主动脉管径约2 mm，其分支非常细且不易结扎，灌注的酶消化液容易经其分支渗漏至管外，使外膜也被消化，导致其他细胞混入；细胞产量亦较低，且大多需同时获取多条动脉，操作复杂；有时因酶的活性改变而使消化时间难以掌控,不仅影响内皮细胞的分离和提取，亦可直接影响内皮细胞的活力［7］。

（转载自http://zw.ＮＳＥaＣ.com科教作文网）

    　　组织块移植培养法操作简单，对细胞活力无损伤，缺点为长出的细胞成分比较复杂，内皮细胞纯度低［8］，常伴有成纤维细胞污染。由于成纤维细胞生长迅速，最终过度生长甚至覆盖内皮细胞而影响内皮细胞增殖。有学者将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行植块培养，提高获取内皮细胞的纯度至67.8%［6］。
    　　本研究采取将大鼠主动脉内膜翻向外、两端内折结扎后直接培养的方法获取血管内皮细胞。结果发现，血管内皮细胞呈现接触性抑制的“鹅卵石”样特征，其标志物vWF表达阳性，未发现杂细胞等，提示获得了数量可观的单1的血管内皮细胞。本研究采用10只大鼠重复实验，均获得了同样的结果，证明该方法具有可重复性。此方法的优势在于：1）获取的血管内皮细胞纯度高、数量多。由于血管两端内折结扎，整段血管仅内膜接触培养瓶，外膜面的细胞不易迁出，经免疫细胞化学染色未发现vWF阴性细胞，有效避免了血管壁其他细胞的混入。1只大鼠的主动脉即可产出5×105个原代内皮细胞，细胞产出量相对较高，经传代培养，可以满足基本实验需要。2）对细胞无损伤。内皮细胞是1种比较娇嫩的细胞。本实验方法无需酶消化，避免了酶消化过程中对细胞的破坏作用，同时节省了酶灌注和消化时间，操作时间短，有效保护了内皮细胞的活力。3）降低实验费用。胰酶廉价、活性强，但对细胞的损伤大，因此多选用对细胞损伤少的胶原酶,但其价格昂贵。本实验不需要酶消化，降低了实验费用。4）操作过程简便、快捷，减少了细胞被污染的几率。
    　　此方法解决了鼠主动脉内皮细胞难获取的问题，也适用于其他较大动物细小血管内皮细胞的分离与培养，为进1步研究其内皮细胞的生物学特性及其相关疾病提供了良好平台。

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【参考文献】
  ［1］ Cole OF, Fan TP, Lewis GP. Isolation, characterization, growth and culture of endothelial cells from the rat aorta[J]. Cell Biol Int Rep, 1986, 10（6）:399-405.
［2］ kobayashi M, inoue K, Warabi E, et al. A simple method of isolating mouse aortic endothelial cells[J]. J Atheroscler Thromb, 2005, 12（3）:138-142.
［3］ Battle T, Arnal JF, Challah M, et a1. Selective isolation of rat aortic wall layers and their cell types in culture-application to converting enzyme activity measurement [J]. Tissue Cell, 1994, 26（6）:943-955.
［4］ Kreisel D, Krupnick AS, Szeto WY, et a1. A simple method for culturing mouse vascular endothelium[J]. J Immunol Methods, 2001, 254（1-2）:31-45.
［5］ Lincoln DW, Larsen AM, Phillips PG, et al. Isolation of murine aortic endothelial cells In culture and the effects of sex steroids on their growth[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2003, 39（3-4）:140-145.
［6］ 林哲绚，罗文鸿，李慧．瞬间热处理大鼠主动脉内皮细胞分离培养法[J]．解剖学杂志，2004，27（5）：571-573．
［7］ 李淑香，王佐周，邱雪杉．酶消化对培养脐静脉内皮细胞的影响[J]．解剖科学进展，2000，6（2）：186．
［8］ Nicosia RF, Villaschi S, Smith M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1994, 30A（6）:394-399.