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1.6二磷酸果糖对大鼠脑缺血再灌损伤后凋亡细胞

2014-07-12 01:05 毕业

【摘要】目的 探讨1、62磷酸果糖（FDP）对大鼠脑缺血/再灌注（I/R）损伤的作用及其机制。方法 雄性SD大鼠90只，随机分为3组：假手术对照组（C组）、脑缺血组（I组）、果糖组（F组），每组30只。I组和F组大鼠在凝断双侧推动脉24小时后夹闭双侧颈总动脉5分钟后重新开放，制作全脑缺血模型，C组只暴露不凝断锥动脉和不夹闭颈总动脉，F组再灌注开始时静脉注射1、6-2磷酸果糖1.5ml/kg，I组及C组分别静脉注射生理盐水1.5ml/kg。各组在再灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h时取标本，测定血SOD、MDA含量，并制备脑组织病理切片，采用免疫组织化学染色方法及TUNEL细胞原位凋亡检测法测定P38蛋白和Ref-1蛋白的表达和凋亡细胞数目。结果 与C组的比较，I组在再灌注后各时点SOD活性明显降低，MDA含量明显升高（P<0.05），F组变化不明显，但较I组比较均有显著差异（P<0.05）；与C组比较，I组凋亡细胞显著增多（P<0.05）；免疫组化染色显示：与C组比较，I组在再灌注后各时点P38、Ref-1表达均显著增强（P<0.05），F组较C组表达增强但较I组表达显著减弱（P<0.05）。结论 1、6-2磷酸果糖对全脑I/R损伤有保护作用，其机理可能与其参与细胞信号转导减弱P38、Ref-1蛋白表达强度有关。
【关键词】 1、6-2磷酸果糖；脑；缺血/再灌注损伤

The protective effects of FDPagainst ischemia reperfusion injury in rat brains
Xue Li, Cai ying min Xue rongliang
Anesthetic Department, the second hospital of Xi’an Jiao Tong University 710004 China
[Abstract] Objective To observe the protective effects of FDP on ischemia reperfusion in rat brains and study its mechanism. Method Healthy 90 rats were randomly divided into 3 groups: sham (group C), Is-Rs(group I), FDP(group F). 30 in one group. The rats’ two carotis were closed after two vertebralis were cut for 24h and opened for 5 minutes in group I and F, the global cerebral ischemia reperfusion model of rats were made. The rats’ vertebralis weren’t cat and carotis communis weren’t closed, FDP 1.5ml/kg was injected into veins when Is-Re began, sodium chloride 1.5ml/kg was injecteo into veins in group I and group C. The samples were picked up at the points of 2h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h after reperfusion, SOD and MDA were measured with immunohistochemical methods, the expression of p38 and Ref-1 and numbers of apoptosis cells were measured with TUNEL. Result: Compared with group C, the activity of SOD at each point decreased MDA increased obviously(P<0.05) after reperfusion in guoup I. The change in group F wasn’t obviously, but Compared with group I, there was great difference (P<0.05), immunohistochemical method showed: Compared with group C, the expression of p38、Ref-1 increased after reperfusion in group I (P<0.05), the expression increased in group F compared with C, but decreased compared with group I (P<0.05), Conclusion: FDP has pretective effects on global ischemia reperfusion jnjury in rats. The mechanism of which might be its decreasing the expression of p38、Ref-1 by participating in cell signal transduction.

[Key words] FDP; brain; I/R
1、6-2磷酸果糖是细胞代谢赋活剂，可维持细胞正常极化状态，增加无氧代谢时ATP含量，通过提供离子泵能量，阻止Ca2+内流，防止活性氧族产生以及维持细胞内Ca2+和Na+正常范围。大量文献报道，其对心肌缺血有明确保护作用，但对脑缺血损伤是否有保护作用以及其作机理尚无定论。近年研究表明，MAPK信号转导通路参与脑缺血再灌注损伤，P38、Ref-1是信号转导通路中的两个蛋白，其表达的改变能间接反映脑缺血再灌注损伤的程度，故本研究拟观察1、6-2磷酸果糖对大鼠脑缺血再灌注损伤过氧化物歧化酶活性（SOD）、丙2醛（MDA）含量及凋亡细胞数目、P38蛋白、氧还因子-1（Ref-1）表达的影响，旨在探讨1、6-2磷酸果糖对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。
材料与方法
90只雄性SD大鼠，由西安交通大学医学院动物中心提供，体重275~325g，随机分为3组：假手术组（C组）、缺血组（I组）、1、6-2磷酸果糖组（F组），每组30只，每组又分6个时点，每个时点随机取5只大鼠进行实验。
I组和F组大鼠凝断双侧椎动脉24h后，夹闭双侧颈总动脉5min后重新开放，用4血管法（4-VO）[1]制备全脑I/R损伤模型。C组只解剖暴露双侧椎动脉及颈总动脉。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠40mg/kg，再灌注开始F组经舌下静脉注射1、6-2磷酸果糖1.5mg/kg（H20040307，浙江浙北药业有限公司），C、I组注射生理盐水1.5ml/kg。密切观察生命体征，观察瞳孔有无变化，呼吸有无增快及神经功能有无异常。瞳孔无变化者予以剔除。
再灌注2、6、12、24、48、72h，1部分取新鲜脑组织检测SOD、MDA，1部分以4%多聚甲醛200ml心脏灌注处死，取出完整大脑，固定于4%多聚甲醛中，制备石蜡切片，用于HE染色、凋亡细胞检测和免疫组化染色。免疫组化采用SP法，P38、Ref-1试剂盒均购于美国Santa Gruz公司，SP试剂盒购于福州迈新生物工程公司，TUNEL凋亡试剂盒购于美国Oncogene公司。阳性细胞为棕黄色。 （转载自http://www.ＮＳＥＡＣ.com中国科教评价网）
脑组织切片中显示细胞浆或细胞核有明显的黄色、棕褐色颗粒或斑片状为P38和Ref-1蛋白阳性。采用德国Leica-Q550E高清晰度彩色图文分析计算机系统对阳性结果进行半定量测定其灰度值。
再灌注损伤后1h、2h、6h、12h、24h、48h，用4%多聚甲醛经心脏灌注固定，断头取脑，制备石蜡切片，HE染色观察细胞组织形态学变化。正常细胞结构清晰可见，细胞核为兰色，核膜完整，核仁明显。
原位末端标记细胞凋亡试剂盒由美国Oncogene试剂公司提供。标本切片常规脱蜡至水，DAB显色、酒精脱水、2甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。定量分析方法为：切片中免疫组化显色阳性细胞定量采用显微镜计数法（10目镜×40物镜），每只动物随机两张切片，每张切片随机观察5个视野。
计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS11.0统计软件进行处理，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
脑组织SOD含量的变化，与C组比较，I组在再灌注各时点均降低（P<0.05），F组在各时点较I组明显升高（P<0.05）。MDA含量的变化，与C组比较，I组再灌注各时点均升高。见表1。
表1 3组大鼠再灌注各时点脑组织SOD和MDA含量的比较
（ n=5, ±s， u•mgprot-1）
指标 组别 2h 6h 12h 24h 48h 72h
SOD C组 86.2±5.8** 86.2±5.7** 87.2±4.0** 88.0±6.3* 86.9±5.5* 87.0±7.2*
I组 70.3±10.3△ 38.9±2.7△△ 58.1±13.1△△ 66.3±13.0△△ 71.9±10.6△△ 70.8±8.3△
F组 85.5±5.5** 79.3±7.5**△ 74.9±8.2*△ 76.3±4.4*△ 82.9±9.8*△ 73.2±10.6*△△
MDA C组 5.3±0.9** 5.3±0.8** 5.4±0.7** 5.4±0.9** 5.3±0.8* 5.4±0.7*
I组 10.1±1.2△△ 7.1±1.5△ 12.9±1.7△△ 13.8±3.6△△ 6.0±1.1 5.9±2.0 （科教作文网 zw.nseac.com整理）
F组 8.7±1.9**△△ 6.9±1.1△ 10.4±1.2**△△ 8.5±1.8**△△ 5.4±1.4* 5.5±1.3
与C组比较△P<0.05 △△P<0.01 与I组比较，* P<0.05 ** P<0.01
脑病理学改变HE染色显示：C组细胞结构清晰完整；I组细胞排列紊乱，间质水肿，神经元数目减少，核膜界限不清，结构模糊；F组仅少数细胞结构破坏。
脑P38和Ref-1蛋白表达的变化：P38、Ref-1表达阳性细胞在胞浆及胞核着色，呈棕黄色颗粒，其灰度值见表2，I组及F组较C组表达增强，但F组较I组明显减弱 。
表2 3组大鼠再灌注不同时点P38和Ref-1表达的灰度变化（n=5， ±s）
指标 组别 2h 6h 12h 24h 48h 72h
P38 C组 197.3±7.4* 203.2±11.0** 205.5±8.9** 204.5±12.7** 200.9±10.5** 198.1±6.4**
I组 142.5±21.8△ 110.4±8.7△△ 99.9±2.8△△ 105.0±6.8△△ 114.3±10.6△△ 126.0±9.5△△
F组 173.9±15.8**△ 143.2±8.2**△ 108.2±7.9*△△ 127.4±2.7**△△ 139.1±5.5**△△ 155.4±4.0 **△
Ref-1 C组 176.9±4.1** 177.4±4.1** 182.5±5.1** 190.5±9.1** 179.7±2.5** 175.0±3.6**
I组 150.5±1.8△ 131.0±2.4△ 106.3±4.0△△ 117.6±2.7△△ 126.6±2.8△△ 140.4±3.7△
F组 159.2±2.8*△ 146.2±4.0**△ 116.2±4.8**△△ 130.8±6.2**△△ 132.6±7.5*△△ 151.0±3.9*△
与C组比较△P<0.05 △△P<0.01; 与I组比较* P<0.05, ** P<0.01
凋亡细胞数目变化：再灌注后2h即可见凋亡细胞，各时间点，F组较I组明显减少，见表3。

表3 大鼠脑缺血再灌注损伤各组凋亡细胞数的变化（n=5, ±s）
组别 2h 6h 12h 24h 48h 72h
I组 26.0±1.5 48.2±1.4 53.4±2.4 53.6±1.8 48.2±1.3 33.2±2.3
F组 21.6±2.0△ 34.2±1.3△△ 44.8±2.3△△ 36.4±2.5△△ 32.2±1.3△△ 21.8±2.1△△
与I组比较△P<0.05 △△P<0.01
讨 论
全脑缺血再灌注损伤是多种病理生理机制共同作用的结果，但其具体机制尚不明确，脑缺血可导致1系列的功能和代谢紊乱，而再灌注可引起更加严重的脑组织损伤，即再灌注损伤或迟发性神经元损伤[2]。最新研究表明，脑I/R损伤引起的细胞死亡还有另1种重要形式——细胞凋亡，脑缺血后促凋亡基因和抗凋亡3基因表达会发生改变[3，4]。
P38和Ref-1是细胞信号转导途径中的两个蛋白，参与调节细胞的分化、增殖与死亡，参与细胞凋亡的发生[5]，但其具体机制尚不明确。有研究认为脑缺血时可能存在由钙离子介导的兴奋性氨基酸（EAA）与活性氧分子（ROS）的恶性循环，ROS可激活P38MAPK通路参与靶细胞的损伤。
本研究发现，脑I/R损伤时P38过度表达，参与细胞凋亡的发生，FDP则可通过减低P38的表达，起到脑保护作用，Ref-1蛋白是维持转录因子还原态的细胞氧还调节因子，参与细胞周期、细胞凋亡、分化、神经元兴奋生理过程，可倍增P53的转录激活功能，促进细胞凋亡，同时还可调控CKII激酶导致的磷酸化修饰。与凋亡负相关[6，7]。本研究结果表明，全脑I/R损伤时，其过度表达参与了细胞凋亡，FDP可通过减弱其表达保护受损神经细胞。
FDP保护作用的机制可能与其增加糖酵解减缓ATP的耗竭，激活磷酸戊糖旁路，防止活性氧族产生，维持细胞内Ca2+、Na+正常范围，防止脑细胞脂质过氧化损伤而改善脑功能。
综上所述，FDP可阻止脂质过氧化反应，提高SOD活性，减少MDA含量，同时参与信号转导通路，减弱P38及Ref-1蛋白的表达，从而产生脑保护作用，但是其确切机制尚待进1步研究。
参考文献
1． Dulsinelli W, Brierly J B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Strodk. 10; 267,1979
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