热化疗联合对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP作用及其

             作者：陈雪琴 马胜林 牟翰舟 苏丹 冯建国

【摘要】  目的 观察热化疗联合对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的影响及其机制，为临床上应用热化疗联合治疗非小细胞肺癌提供理论依据。 方法 CCK-8法检测A549、不同温度下A549 /DDP细胞对顺铂的敏感性；流式细胞仪分析热疗对A549/DDP细胞周期分布的影响；RT-PCR检测热疗对A549/DDP细胞ERCC1表达的影响。 结果 亲代人肺腺癌细胞株A549对顺铂的敏感性明显高于耐药细胞株A549/DDP，不同温度加热后A549/DDP细胞对顺铂的敏感性均有提高；热疗尤其是热化疗后G2/M期细胞明显增多，G0/G1期细胞明显减少（P<0.01）；热疗后A549/DDP细胞ERCC1mRNA表达未见明显改变。 结论 热疗能提高人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP对顺铂的敏感性，热化疗具有协同作用。热化疗协同作用机制可能主要是诱导细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，和DNA修复基因ERCC无直接相关性。

【关键词】  高温 化学疗法 肺肿瘤 抗药性

　　【Abjuctive】  Objective  To observe the effects and mechanisms of hyperthermia therapy combined with chemotherapy on multidrug-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP, it will provide theory evidence in thermochemotherapy for clinic. Methods  A549 or A549/DDP treated with different temperature were detected of sensitivity to cisplatin with CCK-8 assay. After hyperthermia, A549/DDP cell cycle was analyzed with flow cytometry and ERCC1mRNA expression was detected using RT-PCR. Results  Parent human lung adenocarcinoma cell A549 was more sensitive to cisplatin than drug-resistant cell line A549/DDP. Treated with different temperature, drug sensitivity of A549/DDP to cisplatin all increased. Hyperthermia had significant effect on cell cycle with increase of G2/M phase population and reduction of G0/G1 phase population, and thermochemotherapy was more notable（P<0.01）. After hyperthermia, the expression of ERCC1 mRNA did not change. Conclusion  Hyperthermia can significantly enhance the sensitivity to cisplatin in human multidrug-resistant lung cancer cell line A549/DDP. Thermochemotherapy has synergistic effects of inhibiting cell proliferation. The major synergistic mechanisms of thermochemotherapy are that they can induce cell cycle arrest、inhibit cell proliferation ,but have no correlation with gene ERCC1.

　　【Key words】  Hyperthermia  Chemotherapy  Lung cancer  Drug resistance   

　　肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之1，即使最佳的联合治疗，非小细胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer, NSCLC）5年生存率只有15％左右，75％晚期NSCLC患者的中位生存期只有10个月。近年来热疗因其安全有效而逐渐成为继以手术、放疗、化疗、生物治疗后的又1种抗肿瘤手段，而且与其他治疗方法有协同作用，故现正逐渐应用于肿瘤的综合治疗中。但热疗与化疗的协同作用机制错综复杂，目前尚未完全明了，故作者以人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP［１］为对象，观察热疗联合化疗协同抑制该耐药细胞株增殖及其机制，为临床综合治疗提供有力的依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP，重庆第3军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所建立；人肺腺癌亲代细胞株A549，浙江省肿瘤医院肿瘤研究所保存。顺铂（cisplatin, DDP）为云南××制药有限公司产品（批号：050101），CCK-8（cell count kit）试剂盒为日本同仁化研究所产品，P－糖蛋白抗体为法国BC公司产品，PI染色ABC试剂盒为美国BD公司产品，RNA提取试剂和各种PCR引物为上海生工生物工程有限公司产品， PCR反应体系为Promega公司产品。电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；PCR仪（杭州博日科技有限公司）。

　　1.2  方法  

　　(1)细胞培养和热疗处理  将A549和A549/DDP细胞培养于RPMI-1640培养基中，37℃、5％CO2饱和湿度孵箱中培养。热疗采用水浴加温法，将温度调至所需温度稳定1昼夜，次日将细胞培养瓶瓶口密封后浸没于水中。(2)CCK-8法检测A549、不同温度下A549/DDP细胞对顺铂的敏感性  分别收集处于对数生长期的A549、A549/DDP细胞并计数，制成3×104个/ml（A549）或4×104个/ml（A549/DDP）细胞悬液，吸取100μl细胞悬液至96孔板重复6个孔，设无细胞空白对照孔，培养24h细胞贴壁后，加入不同浓度的顺铂终浓度为0.25～16.00μg/ml，并设无顺铂阴性对照孔，其间再给其中3块孔板中的A549/DDP细胞加热，分别42℃作用2h、42.5℃作用2h、43℃作用1h。顺铂作用48h后，加入CCK-8 10μl，3h后全自动酶标仪450nm波长测各孔吸光度OD值，抑制率＝（对照孔OD值－试验孔OD值）/对照孔OD值×100％，计算细胞对顺铂的半数抑制浓度（50％ inhibiting concentration, IC50），即IC50值。耐药倍数= IC50耐药细胞/ IC50敏感细胞，相对逆转效率＝（IC50耐药细胞－IC50加热的耐药细胞）/（IC50耐药细胞－IC50敏感细胞）×100％。(3)实验分组：取对数生长期细胞，接种20×104个细胞于25ml的培养瓶中，培养24h细胞贴壁后，再分成4组。对照组（C组）：未经加温和药物处理A549/DDP细胞；顺铂组（P组）：经1.5μg/ml顺铂作用24h的A549/DDP细胞；热疗组（H组）：经42.5℃作用2h的A549/DDP细胞；顺铂＋热疗组（H+P组）：经1.5μg/ml的顺铂作用24h, 药物作用初同时给予42.5℃热疗2h的A549/DDP细胞。(4)FCM分析各组A549/DDP细胞周期分布：分别收集每组细胞各3瓶，用pH值7.4的PBS缓冲液清洗3遍，用75％预冷酒精固定，并充分振荡混匀，置4℃冰箱中过夜，常规PI染色，上机分析各组细胞增殖各时相DNA含量。(5)RT-PCR法检测  各组A549/DDP细胞切除修复交叉互补基因（excision repair cross-complementing, ERCC1）的表达：ERCC1的上游引物序列为：5′－TAT CCT GGC CGA CTG CAC A－3′，下游引物为：5′－GGA GGT CCG CTG GTT TCT G－3′；以β－actin为内参照，其上游引物为：5′－TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG－3′，其下游引物为：5′－GTC ACC TTC ACC GTT CCA GTT T－3′。每组细胞各取2瓶，弃培养液，用RNA提取试剂盒提取RNA，逆转录按Promega公司的试剂盒说明书进行，次日进行PCR。ERCC1反应体系50μl ，PCR条件为：95℃ 10min，95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s共35循环，再72℃ 10min；β－actin反应体系30μl ，PCR条件为：94℃10min，95℃30s，55℃45s，72℃30s共32循环，再72℃10min。取10μl PCR扩增产物与1μl上样缓冲液混匀, 2%琼脂糖凝胶80V电泳45min，紫外透射仪下观察,并在凝胶成像仪上扫描成像。

　　1.3  统计学处理 

　　应用SPSS 11.0软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多个治疗组间采用方差分析法，F检验。均数间两两比较用SNK-q检验。

　　2  结果

　　2.1  A549、不同温度下A549/DDP细胞对顺铂的敏感性观察 

　　亲代人肺癌细胞株A549对顺铂的敏感性明显高于耐药细胞株A549/DDP，尤其以顺铂浓度1.0～8.0μg/ml为显著，IC50分别为1.43μg/ml和4.26μg/ml；不同温度加热后A549/DDP细胞对顺铂的耐药性均有所下降，以42.5℃作用2h最为明显，IC50为2.98μg/ml，耐药倍数= 2.98，相对逆转效率＝45％（见表1）。 表1  顺铂对A549及不同温度下A549/DDP细胞的抑制率（略）

　　2.2  热疗和/或化疗对A549/DDP细胞周期的影响

　　流式细胞仪分析H组和H+P组G0/G1期细胞较C组、P组明显减少，G2/M期细胞较C组、P组明显增多，且均以H+P组更明显，差异均有显著性（P<0.01）。而S期细胞未见明显改变，且各组均未见明显凋亡现象（见表2）。表2  FCM分析各组A549/DDP细胞周期分布（略） （科教范文网 fw.nseac.com编辑发布）
        
　　2.3  RT-PCR法检测各组细胞ERCC1mRNA表达结果 

　　处理后的各组细胞ERCC1mRNA表达均未见明显改变，提示温热对细胞切除修复交叉互补基因的表达无明显影响，可见，DNA修复机制在热化疗协同效应中未起明显作用。
                                    
　　3  讨论

    肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤，全身化疗是目前大多数NSCLC患者的主要治疗手段，而铂类是NSCLC化疗方案中最基本的药物，但含铂类方案有效率只有30％～47％。许多基础实验和临床试验都已证实热化疗具有协同增强作用，同时也报道热疗能提高铂类化合物的细胞毒性并且能逆转铂类耐药［１，２］。

    本实验观察到温热42℃、42.5℃、43℃均能提高人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP对顺铂的敏感性，对顺铂的IC50分别为3.24μg/ml、 2.98μg/ml、3.88μg/ml，比未加热时A549/DDP细胞的IC50 4.26μg/ml明显低，且以42.5℃最为明显，相对逆转效率＝0.45。Raaphorst［３］等报道40℃和41℃热疗能提高人正常AG152细胞和突变DNA修复酶缺乏XPA细胞对顺铂的敏感性，而且提高程度相似，提示核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）机制在此过程中未起作用。NER是人类最主要及最重要的DNA损伤修复途径，且顺铂导致的DNA损伤主要通过NER途径修复，而ERCC1在NER途径中起着关键性作用。有文献［４］已报道了ERCC1表达水平与铂类药物的敏感性密切相关，其表达水平可以当成铂类药物化疗效果的独立预测指标。作者在前期研究中应用免疫组化方法检测90例有可评价疗效指标的非小细胞肺癌石蜡组织，结果表明ERCC1低表达与顺铂为基础的化疗疗效成正比（资料尚待发表）。本实验用RT-PCR内参法测定热疗对A549/DDP细胞ERCC1 mRNA表达的影响，发现42.5℃加热2h未引起ERCC1 mRNA的改变，因此表明NER机制未参与此协同过程，结果与国外报道［５］1致。 （科教论文网 lw.nSeAc.com编辑发布）
   
　　本实验也观察到42.5℃热疗2h能显著引起G2/M期细胞明显增多，G0/G1期细胞明显减少，与顺铂联合则更明显，与对照组相比差异均有显著性，但未引起凋亡现象；与国外Debes等［６］报道相1致。但具体分子机制尚未明了，有待进1步研究。

【参考文献】
  　　1 Rietbroek RC, Van de Vaart PJ, Haveman J, et al. Hyperthermia enhances the cytotoxicity and platinum-DNA adduct formation of lobaplatin and oxaliplatin in cultured sw 1573 cells. J Cancer Res Clin Oncol, 1997, 123: 6～12.

　　2 Westermann AM, Grosen EA, Katschinski DM, et al. A pilot study of whole body hyperthermia and carboplatin in platinum-resistant ovarian cancer. Eur J Cancer, 2001, 37: 1111～1117.

　　3 Raaphorst GP, Yang DP. The evaluation of thermal cisplatin sensitization in normal and XP human cells using mild hyperthermia at 40 and 41 degrees C.Anticancer Research, 2005, 25(4): 2649～2653.

　　4 Huang PY, Liang XM, Lin SX, et al. Correlation analysis among expression of ERCC-1, metallothionein, p53 and platinum resistance and prognosis in advanced non-small cell lung cancer. Ai Zheng, 2004, 23(7): 845～850．

　　5 Simon GR, Sharma S, Cantor A, et al. ERCC1 expression is a predictor of survival in resected patients with non-small cell lung cancer. Chest, 2005, 127(3): 978～983.

　　6 Debes A, Rommel F, Breise M, et al. In vitro test-system for chemo- and thermosensitivity: an analysis of survival fractions and cell-cycle distributions in human Ewing's sarcomas as a model for tumors in pediatric oncology. Klin Padiatr, 2002, 214(4): 223～229.