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乐胃饮对脾虚型IBS兔胃肠激素与氧自由基的影响

2014-09-07 01:06 毕业

                           作者(冒号)：徐珊 晋丽君 谭涛 张永生 潘永明 陈方明  

【摘要】  　　［目的］观察中药复方乐胃饮对脾虚型IBS兔胃肠激素及氧自由基的影响，探讨乐胃饮治疗脾虚型IBS的可能作用机制。［方法］两月龄白毛黑眼兔（WHBE兔）36只，雌雄各半，随机分为6组(冒号)：正常组、模型组、香砂6君丸组、丽珠肠乐组、乐胃饮低剂量组、乐胃饮高剂量组。除正常组外，其余WHBE兔采用湿热环境应激联合番泻叶灌胃加饥饱失常复合方法致脾虚泄泻型IBS模型。从模型复制的中期开始各用药组预防给药，至造模结束。观察各组1般情况，测定血清NO、NOS、MDA、SOD含量及结肠黏膜组织中SP含量。［结果］模型组WHBE兔血清NO、NOS、MDA含量、结肠黏膜SP阳性表达较正常组均显著升高（P<0.01或P<0.05），血清SOD活力明显降低（P<0.01）。药物干预后，乐胃饮高剂量组血清NO含量较模型组明显降低（P<0.01）；除乐胃饮低剂量组外，余用药组血清NOS活力、血清MDA含量与模型组比较均明显降低（P<0.01或P<0.05）、血清SOD活力明显增加（P<0.01或P<0.05）；各用药组结肠黏膜SP阳性表达较模型组均明显降低（P<0.01或P<0.05）。［结论］乐胃饮能有效调节脾虚型IBS兔胃肠激素的异常分泌及氧自由基的异常表达，这是乐胃饮治疗脾虚型IBS的可能作用机制。

【关键词】  肠易激综合征 胃肠激素 氧自由基 乐胃饮

　　Abstract(冒号)：［Objective］ To observe the effect of Leweiyin of traditional Chinese compounds prescription on gastrointestinal hormones and oxygen free radicals in IBS rabbits of spleen deficiency， and to explore the possible mechanism for the treatment of IBS with spleen deficiency.［Methods］ 36 two瞞onth瞣ld rabbits with white feather and black eyes （WHBE rabbit），half male and half female，were randomly divided into 6 groups(冒号)：normal group，model group，Xiangsha Liujun pill group， Lizhu Changle group， low瞕ose Leweiyin瞭reated group，high瞕ose Leweiyin瞭reated group.Except the normal group， others were made into IBS model of spleen deficiency which was induced by damp heat stress and gavage with Fanxieye as well as method of either hunger or gorge.The drug groups were administered preventively from the medium瞭erm of the model reproduction to the end of modeling.The rabbits of each group were observed.NO，NOS，MDA，SOD in serum and SP in colonic membrane were detected.［Results］ NO，NOS，MDA in serum and SP in colonic membrane significantly more increased than the normal group（P<0.01or P<0.05），and the activity of SOD in serum decreased significantly （P<0.01）.After drug intervention， compared with the model，the serum NO content of high瞕ose Leweiyin瞭reated group decreased greatly（P<0.01）.In addition to low瞕ose Leweiyin瞭reated group， NOS,MDA in serum of other drug groups reduced greatly（P<0.01or P<0.05）and SOD in serum of other drug groups increased（P<0.01or P<0.05）compared with the model group.The positive expression of SP in colonic membrane of the treatment group was significantly lower （P <0.01or P <0.05） than model group.［Conclusion］ Leweiyin can effectively regulate abnormal secretion of gastrointestinal hormones and abnormal expression of oxygen free radicals of IBS rabbits of spleen deficiency， which may be the mechanism for the treatment of IBS of spleen deficiency.

　　Key words(冒号)：irritable bowel syndrome；gastrointestinal hormones；oxygen free radicals；Leweiyin

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　　肠易激综合征（IBS）是临床上最常见的1种胃肠功能紊乱性疾病，表现为1组包括腹痛、腹胀、排便习惯和大便性状异常、黏液便，持续存在或间歇发作，而又缺乏形态学和生化学异常改变的证候群［1］。乐胃饮是治疗腹泻型IBS的经验方，由淮山药、薏苡仁、陈皮组成，主要针对脾虚为本的病机特点，临床疗效满意。本研究主要从乐胃饮调节脾虚型IBS兔胃肠激素及氧自由基异常表达的角度来探讨中药复方乐胃饮治疗IBS的疗效和作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物与分组  两月龄白毛黑眼兔（WHBE兔）36只，雌雄各半，体重约1.5kg，由上虞市星火兔业养殖场提供，实验动物许可证(冒号)：SCXK（浙）2005-0022。将其随机分为6组(冒号)：正常组、模型组、香砂6君丸组、丽珠肠乐组、乐胃饮低剂量组、乐胃饮高剂量组，每组6只，雌雄各半。

　　1.2  主要试剂  1氧化氮（NO）试剂盒、1氧化氮合酶（NOS）试剂盒、丙2醛（MDA）试剂盒、过氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号均为20060910；兔抗SP抗体（1抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号(冒号)：Lot(冒号)：L0106；免疫组化SP法试剂盒(冒号)：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号(冒号)：D14060727；进口正常山羊血清工作液(冒号)：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号(冒号)：60680919；DAB试剂盒(冒号)：购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号(冒号)：60882801。

　　1.3  实验仪器

　　1.4  药物制备  番泻叶由浙江中医药大学第2门诊部提供，用前用90℃热水浸泡两遍，每遍30min［2］，制成含生药量约0.1g/ml浸液。乐胃饮由怀山药、炒薏苡仁、陈皮组成，由浙江中医药大学药学制剂室制备成含生药量2g/ml的煎剂。香砂6君丸(冒号)：杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号(冒号)：051002，用前用水调成0.1g/ml混悬液。丽珠肠乐(冒号)：丽珠集团丽珠制药厂生产，批号(冒号)：20060514，用前用水调成0.0076g/ml混悬液。

　　1.5  造模  将实验兔预养3d，观察无异常情况后进入正式实验。在1空房间内，用电取暖器将室温加热并维持在39℃～40℃。同时，用电热锅将水煮沸，利用水蒸气加大空气湿度，以建立1湿热环境。每天早8点钟起，将除正常组外WHBE兔置于此湿热环境中4h，此期间不予饮水、饮食，湿热应激结束后予以饮水、饮食（予饮食量为正常组的1/2量），连续7d。从第7天起空腹灌服番泻叶浸剂（按30ml/kg标准灌胃）［3］，灌胃结束后予以饮水、饮食（均予足量饮食），连续7d。从灌番泻叶浸剂的第3天起，各用药组WHBE兔下午灌服相应药物（香砂6君丸组按1g/kg灌服香砂6君丸悬液，丽珠肠乐组按0.038g/kg灌服丽珠肠乐悬液，乐胃饮低剂量组按20g/kg、乐胃饮高剂量组按40g/kg分别灌服乐胃饮煎剂），进行预防性药物治疗，模型组予生理盐水灌胃。正常组不予处理，正常饲养。造模时间共14d。

　　1.6  观察指标及检测方法

　　1.6.1  1般情况  观察各组WHBE兔的精神、活动状态、皮毛色泽、反应灵敏性、肛周污秽情况、粪便、饮食、饮水量、体重、肛温。

　　1.6.2  血清1氧化氮（NO）含量及1氧化氮合酶（NOS）活力  处死各组WHBE兔之前，耳缘静脉取血2ml，置1次性塑料试管中，低温暂存，然后放入离心机以3000r/min离心10min，分离血清，保存于-20℃以下待测。采用南京建成生物工程研究所试剂盒，操作按说明书进行。

　　1.6.3  结肠黏膜组织中P物质（SP）的表达  处死各组WHBE兔后，在距肛门2cm以上取肠组织1段，10%中性甲醛固定，石蜡包埋备用。采用免疫组化法测定结肠黏膜SP含量。免疫组化染色行SP法。应用图像分析软件Carl Zeiss Imaging Systems对结肠黏膜SP阳性面积、平均光密度、总光密度（IOD）进行定量分析。DAB显色呈棕黄色颗粒样着色者为染色阳性。

　　1.6.4  血清丙2醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力  处死各组WHBE兔之前，耳缘静脉取血2ml，置1次性塑料试管中，低温暂存，以3000r/min离心10min，分离血清，保存于-20℃以下待测。血清MDA含量测定采用TBA法。血清SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法。严格按照试剂盒说明书进行操作。

　　1.7  统计学方法  采用SPSS15.0统计软件处理，计量资料结果以均数±标准差（x±s）表示，计量资料的多个样本均数比较采用单因素方差分析，显著性水准为a=0.05。

　　2  结果

　　2.1  1般情况  正常组WHBE兔1般情况良好，模型组WHBE兔造模初期焦躁不安，甚至有啃咬铁笼，试图逃出；后期出现精神萎靡，不喜活动，反应迟钝，皮毛枯槁无光泽，喜眯眼，无神，肛周污秽，粪便大多不成形，甚至呈水样便，饮食、饮水量明显减少，体重明显减轻，肛温较低。各用药组上述情况较模型组有不同程度缓解，粪便大多成形，但较潮湿，饮食饮水量、体重都有所增加，肛温升高。

　　2.2  血清1氧化氮（NO）含量及1氧化氮合酶（NOS）活力的表达比较

　　2.2.1  血清NO含量比较  与正常组比较，模型组血清NO含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，乐胃饮高剂量组明显降低（P<0.01），余用药组与模型组比较差异无显著性意义；乐胃饮高剂量组血清NO水平较香砂6君丸组降低（P<0.05），与丽珠肠乐组比较差异无显著性意义；乐胃饮低剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较差异无显著性意义；乐胃饮高剂量组与低剂量组比较血清NO水平降低（P<0.05），见表1。

　　表1  各组兔血清1氧化氮（NO）含量比较（略）

　　与正常组比较(冒号)：**P<0.01；与模型组比较(冒号)：△△P<0.01，※P>0.05；与香砂6君丸比较(冒号)：▲P<0.05，★P>0.05；与丽珠肠乐组比较(冒号)：☆P>0.05；与乐胃饮低剂量组比较(冒号)：□P<0.05

　　2.2.2  血清NOS活力比较  与正常组比较，模型组血清NOS活力增加（P<0.05）；与模型组比较，香砂6君丸组、丽珠肠乐组和乐胃饮高剂量组NOS活力降低（P<0.01或P<0.05），乐胃饮低剂量组较模型组比较差异无显著性意义；乐胃饮高剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较差异无显著性意义；乐胃饮低剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较NOS活力增加（P<0.05）；乐胃饮高剂量组与低剂量组比较NOS活力降低（P<0.05）。见表2。

　　2.3  结肠黏膜组织中P物质（SP）的表达比较  与正常组比较，模型组结肠黏膜SP阳性面积、阳性区域平均光密度、总光密度（IOD）明显升高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组SP阳性面积、IOD均明显降低（P<0.01或P<0.05），乐胃饮高、低剂量组SP平均光密度降低（P<0.05），香砂6君丸组、丽珠肠乐组与模型组比较SP平均光密度虽有所降低但差异无显著性意义；乐胃饮高、低剂量组较香砂6君丸组SP阳性面积降低（P<0.01，P<0.05），与丽珠肠乐组比较差异无显著性意义；各用药组之间SP阳性区域平均光密度、IOD比较差异无统计学意义，见表3及图1~6。

　　表2  各组兔血清1氧化氮合酶（NOS）活力比较（略）

　　与正常组比较(冒号)：*P<0.05；与模型组比较(冒号)：△P<0.05，△△P<0.01，※P>0.05；与香砂6君丸比较(冒号)：▲P<0.05，★P>0.05；与丽珠肠乐组比较(冒号)：□P<0.05，☆P>0.05；与乐胃饮低剂量组比较(冒号)：■P<0.05

　　表3  各组兔结肠黏膜组织中P物质（SP）的表达比较（略）

　　与正常组比较(冒号)：**P<0.01；与模型组比较(冒号)：△P<0.05，△△P<0.01，※P>0.05；与香砂6君丸比较(冒号)：▲P<0.05，▲▲P<0.01，★P>0.05；与丽珠肠乐组比较(冒号)：☆P>0.05；与乐胃饮低剂量组比较(冒号)：●P>0.05

    图1  正常组结肠黏膜SP阳性表达（×400）（略）   

　　图2  模型组结肠黏膜SP阳性表达（×400）（略）   

　　图3  香砂6君丸组结肠黏膜SP阳性表达（×400）（略）   

　　图4  丽珠肠乐组结肠黏膜SP阳性表达（×400）（略）   

　　图5  乐胃饮低剂量组结肠黏膜SP阳性表达（×400）（略）   

　　图6  乐胃饮高剂量组结肠黏膜SP阳性表达（×400）（略）

　　2.4  血清丙2醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力的表达比较

　　2.4.1  血清MDA含量比较  与正常组比较，模型组血清MDA含量明显增高（P<0.01）；与模型组比较，香砂6君丸组、丽珠肠乐组、乐胃饮高剂量组血清MDA含量降低（P<0.01或P<0.05），乐胃饮低剂量组与模型组比较差异无显著性意义；乐胃饮高剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较差异无显著性意义；乐胃饮低剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较血清MDA含量增高（P<0.01，P<0.05）；乐胃饮高剂量组与低剂量组比较MDA含量明显降低（P<0.01），见表4。

　　表4  各组兔血清丙2醛（MDA）含量比较（略）

　　与正常组比较(冒号)：**P<0.01；与模型组比较(冒号)：△P<0.05，△△P<0.01，※P>0.05；与香砂6君丸比较(冒号)：▲▲P<0.01，★P>0.05；与丽珠肠乐组比较(冒号)：□P<0.05，☆P>0.05；与乐胃饮低剂量组比较(冒号)：■■P<0.01

　　2.4.2  血清SOD活力比较  与正常组比较，模型组血清SOD活力明显降低（P<0.01）；与模型组比较，香砂6君丸组、丽珠肠乐组、乐胃饮高剂量组血清SOD活力增加（P<0.01或P<0.05），乐胃饮低剂量组与模型组比较差异无显著性意义；乐胃饮高剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较差异无显著性意义；乐胃饮低剂量组与香砂6君丸组、丽珠肠乐组比较血清SOD活力降低（P<0.05，P<0.01）；乐胃饮高、低剂量组比较差异无显著性意义，见表5。

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