阿米卡星对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤作用(2)

　　将动物随机分成4 组，即对照组10 只，AMK 3 d组11 只，AMK 7 d组12 只，AMK 11 d组13 只。以上4 组中，AMK 3 d组、7 d组和11 d组每天肌肉注射AMK 400 mg/kg，分别连续给药3 d、7 d和11 d;对照组则每日肌肉注射等量生理盐水。用药期间监测动物体重以调整药量。

　　1.4 ABR测试

　　各组动物于用药前及停药后24小时内分别测试ABR。操作在隔音屏蔽室内进行。豚鼠用1 %戊巴比妥钠40 mg/ kg 经腹腔麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下，屏蔽耳机距测试豚鼠外耳道口0.5 cm。应用Smart EP & OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统给予短纯音(tone burst)刺激, 选取4、12、24 kHz 3个频率分别进行测试并记录ABR阈值(听阈)。重复率39.10次/s，带通滤波100～1 500 Hz，叠加1 024 次，扫描时程16.0 ms。声刺激强度从95 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，听阈判定以刚出现ABR Ⅲ波为准并至少重复两次。同一刺激频率下给药前后的听阈差值记为ABR阈移。

　　1.5 耳蜗铺片TRITC-鬼笔环肽荧光染色

　　各组豚鼠于最后一次ABR测试结束后，快速断头，取出听泡。解剖显微镜下去除镫骨，打开前庭窗和蜗窗，用含有4%多聚甲醛的0.1 M PBS(pH 7.4)灌流3 次，并置于该溶液中4 ℃下固定24 h。然后将标本置于8 % EDTA中脱钙2～3 d。PBS漂洗2 次后，于解剖显微镜下分离全耳蜗基底膜。将基底膜置于0.25% Triton X-100溶液中浸泡50 min，然后进行TRITC-鬼笔环肽染色45 min。PBS漂洗后分回铺片，以荧光封固剂封片。荧光显微镜下观察各回毛细胞损伤情况。

　　1.6 统计学分析

　　应用SPSS 16.0统计软件包对实验数据进行统计学分析，数据以±s表示。各组之间ABR阈移的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 TRITC-鬼笔环肽荧光染色

　　荧光显微镜下观察，可见TRITC标记的鬼笔环肽染色呈现红色荧光，主要定位在外毛细胞(outer hair cell, OHC)和内毛细胞(inner hair cell, IHC)的静纤毛、表皮板。此外，Deiter细胞等亦有丝状F-肌动蛋白(F-actin)的表达。

　　对照组耳蜗毛细胞形态结构完好，三排OHC的纤毛呈V 形排列整齐，一排IHC的纤毛呈一形排列，耳蜗各回OHC 和IHC均无缺失(图1 A)。AMK 3 d组耳蜗底回OHC偶有缺失，而其它回OHC以及各回IHC均无损伤(图1B)。AMK 7 d组耳蜗底回OHC的缺失有所增多，并向上发展到第二回;IHC基本正常(图1 C)。AMK 11 d组耳蜗底回OHC出现大量缺失并向上延伸到顶回，缺失区域被Deiter细胞取代形成网状瘢痕;IHC出现散在损伤(图1 D)。

　　2.2 ABR测试