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平贝母内生真菌的分离及其生物碱产生能力的初

2014-08-30 01:24 平贝母内生真菌的分离及其生物碱产生能力的初步研究 ［摘要］ 目的 从平贝母植株中分离内生真菌，从中筛选可以产生与贝母药材相同或相似生物碱的菌株。方法 以平贝母幼嫩植株为材料，用常规微生物学方法分离出其中的内生真菌。以碘化铋钾试剂、碘-碘化钾试剂和碘化汞钾试剂分别对这些真菌的提取物进行生物碱定性检测；再对阳性样品进行TLC分析，并与药材提取物进行比较。结果 从平贝母幼苗中共分离出9种内生真菌，其中一种（Fu7）在3种生物碱定性反应中都呈阳性，其菌丝提取物经薄层层析后，出现两个与药材样品有相同Rf值的斑点。结论 该内生真菌菌株应具有产生贝母生物碱的能力。

　　［关键词］ 平贝母；内生真菌；生物碱

平贝母（Fritillaria ussuriensis）为常用中药材，其中的贝母碱类化合物有清热润肺、止咳化痰等功效。由于对其需求量大，而且植株生长缓慢，野生资源人为破坏严重，自1987年起便被《中国珍稀濒危保护植物名录》列为渐危种［1］。植物内生真菌是指生活在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌，它们在植物体内的存在具有一定的普遍性，其中一部分可能产生一些与其宿主相同或相似的生理活性成分，包括治疗人类疾病的药物［2，3］。因此，如果能从贝母中分离出可以产生贝母碱类生物碱的内生真菌，就有可能采用工业发酵的方法生产其药用成分，这样不仅可以改善目前该药材紧缺的状况，还有利于保护这种珍贵的药用植物资源。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　平贝母引种自吉林市左家中国特产所，栽种于西北大学校园生物实验地，春季取整株幼苗作为分离内生真菌的实验材料。平贝母药材（干燥鳞茎）购自中药店。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 内生真菌的分离

　　用自来水洗净幼苗上的泥土，在75%酒精中迅速漂洗一下，无菌水冲洗后移入5%的次氯酸钠溶液中浸泡8 min，最后用无菌水洗3~5遍。将幼苗切成小段，接种到马丁培养基平板上，置25 ℃条件下培养，切断边缘长出菌丝后，按常规方法进行分离、纯化后转接到PDA斜面上备用。

　　1.2.2 培养

　　将在PDA平板上培养的旺盛生长的各菌株菌丝体制成悬液，分别等量接种于装有50 ml马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中，每种接5瓶。置往复式摇床上25 ℃条件下培养，震荡速度约100次/min。培养5~7天后，将各待测培养物中的菌丝体和培养液过滤分开，菌丝体在60 ℃下烘干备用，滤出的培养液直接用于生物碱的定性检测。

　　1.2.3 样品检测

　　将上述各种菌丝体研碎，分别用80％酒精热提2次，蒸去酒精，浓缩液滴加5%盐酸使成酸性，过滤［4］，即为用于生物碱定性检测的提取液。

取各样品的菌丝体提取液和培养液少量，分别滴加1~2滴以下3种试剂：（1）碘化铋钾试剂（Dragendorff’s reagent），若产生黄至桔红色沉淀则为阳性反应；（2）碘-碘化钾试剂，若产生棕色或褐色沉淀为正反应；（3）碘化汞钾试剂（Mayer’s reagent），生成类白色沉淀者为正反应［5］。

选取上述检测呈阳性的真菌进一步进行薄层层析（TLC）分析。将干燥的平贝母药材粉碎，过60目筛作为对照品，与待测菌丝体都于60 ℃烘箱中烘至恒重，按文献6方法制备样品［6］。将对照品和样品提取液都点样于硅胶G薄板，采用环己烷-醋酸乙酯-二乙胺（6∶4∶1）作为展开剂，改良碘化铋钾试剂为显色剂，进行TLC检测。

　　2 实验结果与讨论

从平贝母幼苗中共分离出9种内生真菌，分别以Fu1~Fu9表示之。培养液的3种定性反应除少数为不确定结果外，均为阴性反应，说明其中不含生物碱或生物碱浓度很低。菌丝体提取液的定性反应结果如表1所示。表1 各种内生真菌菌丝体提取液的定性反应结果（略）