抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用(2)

2014-12-09 01:39

导读：1 材料和方法 1.1 材料青霉素钾标准品, 为本所制备,相对分子质量（Mr）为372.49, 纯度为99.9%; 牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OA）、多聚赖氨酸（Poly睱睱

　　1 材料和方法

　　1.1 材料青霉素钾标准品, 为本所制备,相对分子质量（Mr）为372.49, 纯度为99.9%; 牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OA）、多聚赖氨酸（Poly睱睱ysine, PLL）为Sigma公司产品; DMEM培养液为GibcoBRL公司产品, 新生牛血清购自杭州四季清公司; HAT、 HT、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、 Ig亚类试剂盒均购自Sigma公司, PEG4000购自Fluke公司, BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司, 所用二抗均为Jakson公司产品, 其余均为国产分析纯试剂。Sp2/0细胞由本所细胞室提供, BALB/c 雌鼠（6~8周龄）由本所实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 完全抗原的制备 ①免疫原的制备:参照Haan的方法, 将25 mg青霉素钾溶于pH9.6 Na2CO3缓冲液中, 充分混匀后加入5 mg牛血清白蛋白BSA（或卵清蛋白OA）, 调节pH值至11, 37℃搅拌过夜, 在0.01 mol/L PBS中充分透析至透析液中不再检出有抑菌活性。将透析物分装于-20℃保存。②筛选用包被抗原的制备: 用直链结构的多聚赖氨酸（Poly睱睱ysine, PLL）与青霉素偶联成BPO睵LL, 方法同①。

　　1.2.2 BALB/c小鼠的免疫分别用两种载体偶联的免疫原免疫小鼠, 每只20μg, 皮下多点及四脚掌初次免疫; 14 d后相同剂量腹腔加强免疫, 每2周加强1次, 加强后每隔7 d眼眶采血, 分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价, 于细胞融合前3 d尾静脉加强免疫。