NMDA受体对丙泊酚抑制海马CA1区伤害兴奋性神经元

【摘要目的】：NMDA受体是中枢神经系统最主要的兴奋性递质门控离子通道受体，但对于NMDA受体是否是静脉麻醉要丙泊酚全麻作用的分子靶位，目前尚存在较大的争议和分歧。为此我们采用整体清醒制动大鼠模型，选择海马CA1区伤害兴奋性神经元（NENs）作为研究对象，在体观察了丙泊酚对NENs自发放电的影响作用，旨在确定NMDA受体在其中的可能介导作用。方法：建立整体清醒制动大鼠模型，鉴定并选择海马CA1区伤害兴奋性神经元（NENs）、即给于外周伤害性刺激（有齿镊钳夹大鼠同侧后肢皮肤）后放电迅速增加的神经元进行细胞外电生理记录。药物丙泊酚和NMDA受体拮抗剂（MK801）分别采用静脉全身给药或行内侧隔核局部微注射给药，观察给药前后NENs自发放电的变化情况。结果：共记录到24个海马CA1区伤害兴奋性神经元（NENs），基础放电频率平均为31.98.9spikes/s。其中11个NENs（基础放电频率平均为31.210.5spikes/s），静脉全身给于丙泊酚（2.0mg/kg）后NENs的自发放电明显受抑（4.32.6spikes/s），平均降幅86.2%。而静脉预注射MK801（0.5mg/kg）可显著降低丙泊酚的抑制作用（神经元的自发放电由阻断前的26.45.6 spikes/s下降为12.84.2 spikes/s），平均降幅47.7%（与未用MK801相比，P<0.01）。对于13个记录到的NENs（基础放电频率平均为29.19.5spikes/s），内侧隔核微注射丙泊酚(60ng，Ms)也明显抑制NENs自发放电(10.75.6spikes/s)，平均降幅63.2%。而预先微注射MK801(8ng，Ms)则明显减轻丙泊酚的抑制作用（神经元的自发放电由阻断前的40.712.9spikes/s下降为32.310.7spikes/s），平均降幅20.9%（与未用MK801相比，P<0.01）。结论：丙泊酚明显抑制海马CA1区伤害兴奋性神经元的自发放电，其部分作用是由NMDA受体所介导。 您可以访问中国科教评价网（www.NsEac.com）查看更多相关的文章。
关键词：丙泊酚；NMDA受体；海马神经元；细胞外记录

NMDA receptor involved in the modulation of Propofol on nociceptive excitatory neurons in rat hippocampal field CA1

Yun-Fei Cao, Wei-Zhong Wang, Wei-Feng Yu

Abstract: Object: NMDA receptor is the best characterized excitatory neurotransmitter-gated receptor in mammalian brain, however whether NMDA receptor is one of putative targets involved in general anesthesia of propofol is still under controversial. Here we established the model of extrcellular recording of a single neuron in the hippocampal CA1 area in intact awake rat, and examined the inhibition of propofol on the spontaneous activities of nociceptive excitatory neurons(NENs) and the possible roles of NMDA receptor involved.
Methods: Spontaneous activities of the dorsal hippocampal field CA1 neurons were extracellularly recorded by single-barreled electrode in intact awake rat, which was paralyzed with pancuronium and whose respiration controlled via a nonrebreathing system. Nociceptive excitatory neurons(NENs) were identified electrophysiologically due to a quick increase in their discharge frequencies induced by mechanical noxious stimulation, and the effects of propofol administrated via intravenous injection(IV) or microinjection into medial sepato nucleai (Ms) on NENs, were observed with or without the pretreatment of MK-801(NMDA receptor antagonist).
Results: Of total 24 NENs recorded, the averaged maintained firing rate of these neurons was 31.98.9 spikes/s.In 11 NENs(baseline spontaneous discharges 31.210.5spikes/s) , Intravenous injection of propofol(2.0mg/kg) markedly suppressed the neural activity of NENs(4.32.6 spikes/s),with an average reduction of 86.2%. While pretreated with MK801(0.5mg/kg, IV) ,The propofol-induced suppressive effects were obviously attenuated(26.45.6spikes/s to 12.84.2spikes/s) ,with an average reduction of 47.7%(as compared to that without MK801, P<0.01); In another 13 NENs(baseline spontaneous discharges 29.19.5spikes/s) , microinjection of Propofol(60ng, Ms) effectively inhibited the discharge activities of NENs in CA1 field(29.19.5 spikes/s to 10.75.6 spikes/s), with an average reduction of 63.2%. while pretreated with MK801(8ng) , the inhibition of Propofol was siginificantly reduced(40.712.9 spikes/s to 32.310.7spikes/s), with an average reduction of 20.9%(as compared to that without MK801, P<0.01). （转载自http://www.ＮＳＥＡＣ.com中国科教评价网）
Conclusion: Our in vivo electrophysiological recording clearly showed that propofol markedly inhibits the electrophysiological activities of nociceptive excitatory neurons(NENs) in hippocampal field CA1, and the suppressive effects are mediated in part by NMDA receptor.
Key words: Propofol; NMDA receptor; Hippocampal neurons; Extracellular recording

全麻药物主要通过抑制中枢的兴奋性突触传导和/或增强抑制性突触传递而发挥全麻作用，其中突触后的递质门控离子通道是其最为敏感的分子靶位[1,2]。对于静脉麻醉要丙泊酚的全麻作用机制，目前的研究多认为是通过作用于GABAA受体而增强中枢的抑制性突触传递、并发挥全麻效应。而对于介导兴奋性突触传递的NMDA受体是否是丙泊酚全麻作用的分子靶位，目前尚存在较大的争议和分歧[1,3]。为此我们采用整体清醒制动大鼠模型，并选择海马CA1区伤害兴奋性神经元（NENs）作为研究对象，旨在观察丙泊酚对NENs自发放电的影响及NMDA受体在其中的可能介导作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和材料 雄性SD大鼠，体重 253-337g。均购自上海市计划生育研究所实验动物中心。脂溶剂丙泊酚（Diprivan）：为ZENECA Limited公司产品，批号AY208。立体定位仪：Narishige，日本。微电极放大器:：Nihon Konden，日本。交流放大器：第2军医大学生理学教研室。双线示波器：National，日本。生理刺激器：Nihon Konden，日本。时程与幅度窗口鉴别器：生理所生物医学仪器公司。人工呼吸机：浙江医科大学医学仪器实验厂。血压换能器：复旦大学电子仪器厂。微电极拉制仪：Narishige，日本 。
1.2 手术处理 大鼠称重后腹腔内注射戊巴比妥钠60mg/kg进行诱导麻醉，麻醉完全后行气管插管和右股动脉、静脉插管，动脉导管连接压力传感器后计算机（PC486）监测血压，两前肢皮下插入针头并连接心电极以监测心电图。动物取俯卧位，头部固定于脑立体定位仪（Narishige）上，2%利多卡因（0.3ml）行局部浸润后，切开颅顶部皮肤，按Paxinos and Watson 图谱在海马CA1区颅骨投影点，(AP：-4.0mm；L:2.0mm)处钻开颅骨，直径约3.0mm。待动物清醒后，静脉推注1%3碘季铵酚40mg/kg 制动，并以4mg/kg/h维持，并行人工通气 (1012 ml/kg ，6070 times/min)。用琼脂生理盐水棉球将创面周围围起成1池状，池中倒入温液状石蜡以保护神经和创面。整个实验过程中终末潮气的CO2浓度维持在4%5%，红外线灯给动物保温使直肠温度维持在37°C左右。 本文来自中国科教评价网
1.3 细胞外记录和神经元性质的鉴定 玻璃微电极内灌入3%滂胺天蓝（Pontamine Sky Blue，PSB）-0.5mol/L醋酸钠溶液，阻抗为410 MΩ。在海马CA1区（P:3.8-4.2mm，L:1.8-2.2mm，D:2.5-3.0mm），与脑面成20°角度插入玻璃微电极。记录的神经元自发放电活动，经信号放大器（Nihon Kohden，MEZ-8210）放大（过频率1003000 Hz）后用时程-幅度窗口鉴别器（中科院上海生理所，TAWD-94）鉴别单1神经元的动作电位，使之整形成1ms的标准方波，输入计算机进行频率积分。待单位放电稳定510min后，对神经元的性质进行鉴定。伤害刺激（有齿镊钳夹同侧后肢皮肤）后放电迅速增加的神经元被认为是伤害兴奋性神经元（nociceptive excitatory neurons, NEN）。
1.4 静脉用药和细胞外记录 通过股静脉途径给药，给药剂量丙泊酚为2mg/kg，NMDA受体拮抗剂（MK801）为0.5mg/kg。均采用微量注射器给药，注射体积0.2ml/次，给药时间1015秒，观察丙泊酚对海马CA1区伤害兴奋性神经元自发放电的影响。同1种药物两次给药间隔时间均超过20min。
1.4 脑内微注射和细胞外记录 自行拉制多管（3管）微电极，分别灌入0.9%NaCl、分析纯丙泊酚（600ng/l）、或MK-801（80ng/g），采用微量注射器行脑内微量注射，每次注射体积0.1l。记录电极及神经元的性质鉴定同上。
1.5 被记录神经元在海马CA1区的分布 实验结束后，分别向神经元记录部位微电泳PSB(-10 A，10 min)，先后用生理盐水150 ml和10%福尔马林溶液200 ml经左心室灌流。取脑并将其浸泡于10%福尔马林溶液中，用冰冻切片机将海马区域作50 m的冠状切片，并在显微镜下寻找染点，根据Paxinos and Watson图谱确定这些神经元在海马CA1区的分布（海马CA1区以外位点不计在内，如图5所示）。结果显示，记录的神经元位点位于海马背侧的CA1区，不同特性的伤害调制性神经元在海马CA1区的分布未见无明显的差异。 （转载自中国科教评价网www.nseac.com ）
1.6 统计学处理 神经元放电频率采用平均数±标准差表示，静脉注射药物后单位放电频率变化超过20%认为有意义。单位放电变化用配对资料t检验，P<0.05为相差显著，P<0.01为相差有非常显著意义。
2 结 果
2.1 海马CA1区单个神经元的电生理特征
在海马CA1区共记录到24个神经元，均呈不规律、短暂的自发放电（spike），基础放电频率为2~68 spikes/s（31.98.9 spikes/s）。在钳夹同侧后肢后均出现快速兴奋现象（自发放电频率显著增加>20%），确定为伤害兴奋性神经元（NEN）。
2.2 丙泊酚静脉给药对海马CA1区伤害兴奋性神经元自发放电的影响
对海马CA1区记录到的11个伤害兴奋性神经元，采用丙泊酚静脉注射(注射体积0.2 ml，剂量2.0mg/kg)，结果显示，丙泊酚对于海马CA1区伤害兴奋性神经元自发放电有明显的抑制作用，如图2所示。丙泊酚(2mg/kg，iv)可使神经元放电迅速抑制，平均放电频率从基础的31.210.5 spikes/s下降为4.32.6 spikes/s，平均降幅(86.2%)，作用持续时间3.10.2min。而静脉预注射NMDA受体拮抗剂MK-801（0.5mg/kg）可减轻丙泊酚的抑制作用，即恢复10min后静脉注射MK-801 (0.5mg/kg,iv)，可见神经元的自发放电频率迅速下降，8分钟后放电频率趋于平台期，其放电频率稳定在较低水平（26.45.6 spikes/s），再次注射丙泊酚(2mg/kg,iv)，其放电频率迅速降至12.84.2 spikes/s，平均降幅47.7%，作用持续时间3.10.2min。与自身前对照性配对t检验，应用MK-801后，丙泊酚抑制神经元自发放电的平均降幅（放电抑制率）明显下降（P<0.01），但其作用持续时间无明显变化，如图2所示。其中4个神经元在60min后再次注射丙泊酚用作后对照，与前对照的丙泊酚抑制作用相比，未见明显差异。 （科教作文网http://zw.nseAc.com）
 
Fig2：Systematical coadministration of MK-801 and Propofol affected the spontaneous discharges of NENs in rat hippocampal CA1

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2.3 丙泊酚内侧隔核内给药对海马CA1区伤害兴奋性神经元自发放电的影响
对海马CA1区记录到的13个伤害兴奋性神经元，采用内侧隔核内微注射给药，结果显示，内侧隔核内微注射丙泊酚(60ng)明显抑制NEN的自发放电，如图3所示。丙泊酚(60ng，Ms)可使NENs放电迅速抑制，平均放电频率从基础的29.19.5spikes/s下降为10.75.6spikes/s，平均降幅63.2%，作用时程1.20.2min。恢复10min后内侧隔核内微注射MK801 (8ng)，可见神经元的自发放电频率出现1过性的抑制作用，其中4个神经元的放电在抑制恢复后出现放电增加现象，如图3所示。8分钟后放电频率趋于平稳，放电频率平均40.712.9 spikes/s，内侧隔核内再次微注射丙泊酚(60ng，Ms)，发现NENs的放电频率迅速下降为32.310.7 spikes/s，平均降幅20.9%，作用持续时间1.20.2min。其中两个神经元在MK-801微注射后1.5h，再次于Ms内微注射丙泊酚（60ng），其产生的抑制作用与自身的前对照相比，波幅略有下降，但无明显差异。与自身前对照性配对t检验，应用MK-801后，丙泊酚抑制神经元自发放电的平均降幅（放电抑制率）明显下降（P<0.01），但其作用持续时间无明显变化，如图3所示。
 
Fig3：Local coadministration of MK-801 and Propofol affected the spontaneous discharges of NENs in rat hippocampal CA1

3 讨 论
NMDA受体是中枢神经系统最主要的兴奋性递质门控离子通道受体，但对于NMDA受体是否是静脉麻醉要丙泊酚全麻作用的分子靶位，目前尚存在较大的争议和分歧[1，2]。Yamakura T等在表达重组谷氨酸受体及其亚型的瓜蟾卵母细胞上，发现25M 和300M异丙酚可分别抑制（50M）NMDA诱发的电流峰值约8%和34%[4]。Orser BA等的研究表明，异丙酚可浓度依赖性地抑制培养的小鼠胚胎海马神经元（50M）NMDA诱发电流，其IC50值约为160M，其中10M异丙酚可使（50M）NMDA的诱发电流减少10%20%[5]。Hans P等的研究表明，在培养的

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