Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再
2015-04-06 01:09
导读:医学论文毕业论文,Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再论文模板,格式要求,科教论文网免费提供指导材料:毕业
【摘要】 目的 探讨乳化异氟醚预处理对大鼠
毕业
【摘要】 目的 探讨乳化异氟醚预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用,并且证明这1作用由Kupffer细胞介导。方法 将SD大鼠制成肝脏缺血再灌注模型,随机分为脂肪乳剂对照组(C) 、Kupffer细胞阻断对照组(CK) 、乳化异氟醚预处理组(IPC)和Kupffer细胞阻断后乳化异氟醚预处理组(IK),观察肝脏缺血60min 再灌注2h 后血清中谷丙转氨酶(ALT) 、谷草转氨酶(AST)、肝细胞匀浆丙2醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和肝组织病理学改变。结果 C组、CK组和IK组肝脏缺血再灌注后血清ALT 和AST 含量显著升高,肝细胞匀浆MDA含量增高,SOD含量降低,肝组织病理学损害明显增加;而IPC组肝脏缺血再灌注后血清ALT 和AST 含量与前3组相比显著降低,肝细胞匀浆MDA含量减少,SOD含量增加,肝组织病理学损害明显减轻。结论 乳化异氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用,并且这1作用由Kupffer细胞介导。
【关键词】 Kupffer细胞;乳化异氟醚;缺血再灌注损伤
Kepffer cells mediated emulsified isoflurane precondition against hepatic ischemia and reperfusion injury in the rats
LV Hao,YANG Li-qun,YU Wei-feng,REN Hong-mei,ZHU Min,XU Li-ya.Department of Anesthesiology,Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai 200438,China.
Corresponding author:YU Wei-feng
【Abstract】 Objective To investigate the protective effect of pretreatment with emulsified isoflurane on liver ischemia and reperfusion injury in rats. Methods A total of 32 healthy adult SD rats,weighing between 250 g to 300 g,were randomly divided into four groups: preconditioning with intralipid group (C , n = 8),inhibition of Kupffer cell and preconditioning with intralipid group (CK,n = 8), preconditioning with emulsified isoflurane group (IPC,n = 8), inhibition of Kupffer cell and preconditioning with emulsified isoflurane group (IK,n = 8). Rats suffered from ischemia for 30 min and were followed by reperfusion for 2 hours. The amimals were killed at 2 hours after reperfusion. Serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were determined.Hepatic cell homogenate levels of MDA and SOD were determined. The histopathologic changes in the liver were also observed. Results Compared with those in C ,CK and IK groups,in IPC group serum levels of ALT and AST decreased significantly after liver ischemia and reperfusion. Hepatic cell homogenate levels of MDA decreased and SOD increased. The injury degrees of liver histopathology in IPC group was much less than that in C,CKand IK groups. Conclusion Pretreatment with emulsified isoflurane can protect liver from ischemia and reperfusion injury and this effect may mediated by Kupffer cells.
(科教作文网http://zw.NSEaC.com编辑发布)
【Key words】 Kupffer cells; emulsified isoflurane; ischemia and reperfusion injury
最近的研究显示异氟醚等吸入麻醉药预处理对大鼠心、脑、肾、肺、脊髓早期的缺血再灌注损伤有保护作用,并且揭示了部分的作用机制[1-5] 。吸入麻醉药对肝脏的影响,过去研究大多集中在对肝脏的毒性作用,然而,吸入麻醉药可诱发肝脏的保护作用。在大鼠缺血再灌注及培养肝细胞缺氧复氧损害模型中,异氟醚、7氟醚和氟烷能减轻早期缺血再灌注或缺氧复氧损害[6-7]。异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用目前国内外的研究不多,其机制的研究还处于起步阶段。本实验拟采用大鼠肝脏缺血再灌注模型,研究异氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用,以期为临床合理用药提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 研究对象
SD大鼠32只,雄性,质量250~300 g,由第2军医大学实验动物中心提供。将动物分为4组:脂肪乳剂对照组(C组, n =8),经大鼠尾静脉用微量泵给予脂肪乳剂预处理,剂量为30%脂肪乳剂(华瑞制药有限公司提供)6ml/kg/h,持续给药半小时,停药15分钟,然后进行缺血再灌注;Kupffer细胞阻断对照组(CK组, n =8) ,实验前24h大鼠腹腔注射Kupffer细胞特异性阻断剂氯化钆(10mg/kg),其余同C组;乳化异氟醚预处理组(IPC组, n =8),经大鼠尾静脉用微量泵给予乳化异氟醚预处理,剂量为8%乳化异氟醚6ml/kg/h,持续给药半小时,停药15分钟,然后进行缺血再灌注;Kupffer细胞阻断后乳化异氟醚预处理组(IK组, n =8) , 实验前24h大鼠腹腔注射Kupffer细胞特异性阻断剂氯化钆(10mg/kg),其余同IPC组。
1. 2 乳化异氟醚配制
8% 乳化异氟醚的制备是在无菌条件下于20 ml 消毒安瓿中分别加入30 % 脂肪乳18.4 ml 和液态异氟醚1.6 ml,用酒精喷灯封接安瓿,于混旋振荡器上振荡15 min,使液态异氟醚充分乳化[8]。
(转载自http://zw.NSEaC.com科教作文网)
1. 3 肝脏缺血再灌注模型的制作
大鼠术前12h禁食,自由饮水,腹腔注射3% 戊巴比妥钠(30 mg/ kg) 麻醉,上腹正中切口进腹,分离肝脏周围韧带,暴露肝门, 游离肝门部血管,用小号动脉夹阻断门静脉左、中分支( 约占全肝70%) ,完全夹闭门静脉和肝动脉,完全阻断左、中肝脏血流,造成左、中肝叶完全缺血,保留右肝(约占全肝30 %) 血供,作为门静脉血液回流通道,以防肠道淤血。同时大鼠尾静脉穿刺置入24G套管针,后接微量泵进行预处理给药。微量泵持续给药30min,停止15min,然后肝门部分阻断(左、中)30min,后去除肝门阻断夹,恢复肝脏灌流,再灌注2h后取标本。
1. 4 标本采集及检测方法
所有动物于实验结束收集下腔静脉血4 ml,离心析出血清,以日本产Olympus AU 2700 型全自动生化分析仪,测定血清中谷丙转氨酶(ALT) 、谷草转氨酶(AST) 含量。取新鲜肝左叶组织制成10%肝组织匀浆,用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物制剂有限公司)测定肝组织蛋白含量,并用MDA和SOD试剂盒(南京建成生物制剂有限公司)测定肝组织匀浆MDA和SOD含量。同时取肝左叶组织置10 % 甲醛液中固定,常规切片和HE 染色,光镜下观察肝组织病变情况。选取损伤最为明显的再灌注24 h 的病理切片,光镜下评定肝组织损伤分级,其分级标准:0级:肝小叶、肝细胞、肝细胞索、中央静脉、肝窦均正常;Ⅰ级:个别肝细胞变性,汇管区少量炎细胞聚集;Ⅱ级:肝中央静脉、肝窦内瘀血及散在肝细胞变性坏死,肝组织内炎细胞聚集较多,肝小叶结构完整;Ⅲ级:肝中央静脉、肝窦内瘀血及广泛肝细胞变性坏死,大量炎细胞聚集,部分肝组织结构破坏不完整。
1. 5 统计学处理
采用SPSS11.0 统计软件,所有数据以x±s 表示,多组均数比较的方差分析检测各组间的差异,肝组织损伤分析用秩和检验。
(科教范文网 fw.nseac.com编辑发布) 2 结果
2. 1 血清酶学变化结果见表1
脂肪乳剂对照组、Kupffer细胞阻断对照组和Kupffer细胞阻断后乳化异氟醚预处理组缺血再灌注后血清ALT 、AST水平均显著升高,3组间比较均无统计学差异。乳化异氟醚预处理组缺血再灌注后血清ALT 、AST水平与前3组相比均明显降低,其差异均有统计学意义( P <0.05) 。
2. 2 肝细胞匀浆MDA和SOD变化见表1
脂肪乳剂对照组、Kupffer细胞阻断对照组和Kupffer细胞阻断后乳化异氟醚预处理组缺血再灌注后肝细胞匀浆MDA水平均显著升高,SOD水平均显著降低,3组间比较均无统计学差异。乳化异氟醚预处理组缺血再灌注后肝细胞匀浆MDA水平与前3组相比均明显降低,SOD水平与前3组相比均明显升高,其差异均有统计学意义( P <0.05) 。
表1 各组再灌注2h后ALT 、AST、MDA、SOD含量(x±s,n = 8)
组别 ALT(IU/L) AST(IU/L) MDA(nmol/mg) SOD(NU/mg)
C组 548.79±350.31+ 1247.39±678.81+ 4.95±0.74+ 69.16±7.11+
CK组 530.91±297.25▲ 747.45±420.18▲ 5.02±0.64▲ 71.86±2.99▲
IK组730.55±542.81★ 1786.95±1124.23★ 5.22±0.90★ 72.03±6.89★
IPC组205.06±79.88 483.28±151.89 3.54±0.66 87.77±5.52
与IPC组比较,+P <0.05,▲P <0.05,★P <0.05
上1页
12 下1页
[NextPage]
2. 3 肝组织病理学改变
C组肝脏再灌注后2 h,肝中央静脉、肝窦内瘀血,广泛肝细胞变性坏死,汇管区大量炎细胞聚集,部分肝组织结构破坏不完整,见图1;CK组再灌注后2 h,主要以肝细胞局灶性及片状坏死为主,汇管区炎细胞浸润,中性粒细胞为主, 部分肝窦扩张、淤血,肝细胞可见不同程度的水肿变性和空泡状变性,偶尔可见点状坏死,见图2;IK组肝脏再灌注2 h,肝中央静脉、肝窦内瘀血,部分肝细胞变性坏死,肝组织内炎细胞聚集较多,见图3;IPC组再灌注后2 h,部分肝细胞气球样变,偶尔可观察到灶性坏死,未见成片状细胞坏死,肝小叶结构完整,未见组织结构破坏,见图4。
内容来自www.nseac.com 再灌注2 h 病理切片肝组织损伤分级,属于Ⅱ~Ⅲ级范畴的动物数:C组8例,CK组7例,IK组8例,IPC组只有1例,其余CK组1例,IPC组7例属于0~Ⅰ级。C组、CK组和IK组比较肝组织损伤程度无统计学差异,而IPC组与前3组相比肝组织损伤程度显著降低,其差异均有统计学差异( P <0.05)。
图1 C组再灌注后肝脏组织变化 (HE ×200)
图2 CK组再灌注后肝脏组织变化 (HE ×200)
图3 IK组再灌注后肝脏组织变化 (HE ×200)
图4 IPC组再灌注后肝脏组织变化 (HE ×200)
3 讨论
目前的研究表明以异氟醚为代表的吸入麻醉药预处理对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用,其可能的机制有:(1)减少细胞外氧应激产生O2-。来源于肝脏Kupffer细胞的细胞外氧应激是导致再灌注初期血管和肝细胞损伤的主因。异氟醚可抑制肝脏复氧后O2-产生,通过减少细胞外氧应激保护了肝细胞活性[9]。(2)对肝细胞的能量保护作用。能量供应是肝细胞维持1切活动的基础,异氟醚对不可逆缺氧和复氧的能量失衡都有重要的保护作用[10]。(3)减轻细胞内Ca2+超载等。
本研究中乳化异氟醚预处理组与脂肪乳剂对照组相比肝脏缺血再灌注后血清ALT、AST以及肝组织中MDA水平明显减轻,肝组织中SOD水平明显增加,并且肝组织病理损害也明显减轻,说明乳化异氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤有明显的保护作用。用特异的Kupffer细胞阻断剂氯化钆阻断后再用乳化异氟醚进行预处理,肝脏缺血再灌注后血清ALT、AST,肝组织中MDA、SOD水平以及肝组织病理损害与脂肪乳剂对照组相比无显著差异,证明了乳化异氟醚预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用由Kupffer细胞介导。
内容来自www.nseac.com Kupffer 细胞是位于肝血窦腔内的巨噬细胞,它寄居于肝血窦内皮细胞之上或之间,并通过突入内皮细胞下Disse 间隙的胞浆突起与肝细胞直接接触。Kupffer 细胞作为与从胃肠道内吸收的微粒和免疫活性物质接触的第1 道防线,具有胞吞、胞饮,抗原提呈和分泌生物活性物质3 大功能。肝脏缺血再灌注后Kupffer细胞被门静脉血中的内毒素(LPS)激活,激活的Kupffer 细胞吞噬功能增强并产生反应性氧元素(ROS)等许多生物活性物质,这些物质可对进入肝脏的细菌、病毒、内毒素和许多毒性物质进行代谢解毒,对肝脏起了1定的保护作用。但同时ROS协同Kupffer 细胞激活后分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)等促炎性细胞因子加重肝脏的缺血再灌注损伤。有实验认为抑制Kupffer细胞的激活可以减少ROS 的产生及中性粒细胞的浸润,从而减轻肝脏的缺血再灌注损伤[11],但也有实验相反的意见[12-13]。Ching-Mei Hsu等人的研究认为Kupffer细胞通过诱生型1氧化氮合酶(iNOS)依赖的机制对肝脏的缺血再灌注损伤早期起到明显的保护作用,而1氧化氮(NO)在抗肝脏缺血再灌注损伤中发挥了重要的作用[14]。1氧化氮合酶(NOS)是NO生成的限速酶,催化L-精氨酸生成瓜氨酸及NO,因此,NOS是NO作用的关键因素。 NOS在肝脏分诱生型1氧化氮合酶(iNOS)和内皮型1氧化氮合酶(eNOS),而iNOS的合成能力远大于eNOS,应激时iNOS是NO合成增多的重要原因。NO通过减低肝内血管阻力,改善肝微循环,从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。因此,Kupffer细胞可能通过激活iNOS,增加NO的合成,从而减轻肝脏的缺血再灌注损伤。
本实验证实Kupffer细胞直接介导了乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用,其作用机制可能依赖于NO通路,我们下1步的工作旨在证实Kupffer细胞与NO通路的关系,并进1步研究异氟醚肝保护作用的信号传导通路,希望我们的工作能够初步揭示异氟醚等吸入麻醉药肝保护的分子机制,为肝脏手术合理选择全麻药物奠定理论基础。
您可以访问中国科教评价网(www.NsEac.com)查看更多相关的文章。
参考文献:
[1] Wang C, Weihrauch D, Schwabe DA, et al.Extracellular signal-regulated kinases trigger isoflurane preconditioning concomitant with upregulation of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor expression in rats. Anesth Analg,2006,103: 281-288.
[2] Zheng S,Zuo Z.Isoflurane preconditioning decreases glutamate receptor overactivation-induced Purkinje neuronal injury in rat cerebellar slices. Brain Res,2005,1054:143-151.
[3] Hashiguchi H, Morooka H, Miyoshi H,
[1]