评价网 > 科教论文 > 医学毕业论文 > 药学论文 > 正文

滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤

2013-07-04 01:07 作者：战丽彬, 钟军华, 路小光, 隋华, 韦巍
【关键词】 内质网; 衣霉素; 葡萄糖调节蛋白78; 凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白; 小鼠
　　内质网（endoplasmic reticulum, ER）广泛存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠、运输以及细胞内钙离子储存的主要场所。内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白质蓄积可引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS），发生具有保护作用的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。神经系统许多疾病与内质网应激相关。最近的研究表明，内质网应激介导的凋亡信号传导途径可能与阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）的发病有关。本研究观察滋补脾阴方药（Zibu Piyin Recipe, ZBPYR）含药血清对由N蔡橇匆种萍烈旅顾兀╰unicamycin, Tm）引起的内质网应激的影响，以探讨其神经保护机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验药物 滋补脾阴方药由清代吴澄《不居集》中资成汤加味而成，由红参30 g，山药15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹参12 g，白扁豆15 g，莲肉20 g，石菖蒲10 g，远志10 g，檀香4.5 g，橘红9 g，甘草9 g组成，均购自大连医药集团药材公司。中药常规水煎，每毫升中药液含生药3.29 g，4 ℃保存备用。
　　1.2 主要试剂和仪器 达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)和胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶和TRI睷eagent，Sigma公司产品；Tm，星形孢菌素（staurosporine, STS），日本Wako公司产品；细胞毒性检测试剂盒，Roche公司产品；RNase OUT和Oligo (dt)，Invitrogen公司产品。二氧化碳恒温培养箱，Thermo Forma公司产品；台式高速冷冻离心机，Sigma公司产品；UV754紫外分光光度计，上海分析仪器总厂产品；温度梯度PCR扩增仪，Thermo Hybaid公司产品；酶标仪，美国BIO睺EKTM公司产品；凝胶成像分析系统，UVP公司产品。
　　1.3 中药血清制备 取健康雄性SD大鼠（220～250 ｇ）12只，随机分为对照组和ZBPYR组，每组6只。适应饲养3 d后，ZBPYR组给予滋补脾阴方药灌胃，10 ml/kg体质量，此剂量灌胃2次/d，连续3 d；对照组给予等体积生理盐水灌胃。于末次给药后1 h腹主动脉取血，静置2 h，2 000 r/min，4 ℃离心15 min分离血清，离心半径为16.1 cm，56 ℃，30 min灭活。0.22 μm滤膜过滤除菌，－20℃保存备用。
　　1.4 Neuro2a细胞的培养 小鼠神经瘤母细胞Neuro2a细胞株由日本北海道大学药学部野村靖幸教授惠赠。细胞常规复苏后加入培养液于5% CO2、37 ℃培养箱培养。细胞单层长满后用终浓度为0.25%胰蛋白酶37 ℃条件下消化3 min，以1∶3传代。培养液含90% DMEM、10%胎牛血清和1％双抗。细胞长至第三代可以使用。
　　1.5 乳酸脱氢酶释放试验 Neuro2a细胞接种后分为对照组、10％空白血清组、5％ZBPYR组、10％ZBPYR组、15％ZBPYR组、Tm（5 μg/ml）组、10％空白血清＋Tm（5 μg/ml）组、5％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组、10％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组、15％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）组。细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％CO2、37℃培养箱继续培养48 h后用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放试验检测LDH泄漏率。LDH实验步骤按试剂盒说明执行。LDH泄漏率为细胞上清中LDH活性与细胞总的LDH活性比值。LDH活性测定用酶标仪于490 nm处检测。另外Neuro2a细胞接种后分为对照组、STS（0.1 μmol/L）组、10％空白血清＋STS（0.1 μmol/L）组、15％ ZBPYR＋STS（0.1 μmol/L）组，待细胞单层长至70％时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5％ CO2、37 ℃培养箱继续培养48 h后检测LDH泄漏率。
　　1.6 逆转录聚合酶链式反应 实验分组同前。细胞单层长至90％时按以上分组给予相应刺激。细胞放入5％ CO2、37 ℃培养箱继续培养6 h。总RNA的提取和逆转录聚合酶链式反应。（1）收集细胞用TRI睷eagent提取总RNA。用紫外分光光度计测定A260/A280，计算RNA浓度。（2）逆转录反应。反应体系为20 μl。取2 μg总RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水至总体积为9 μl，加0.5 μl Oligo (dt) 1218引物混合后，置70 ℃变性10 min。然后加入下列成分：5×第一链缓冲液5.875 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase抑制剂0.5 μl和逆转录酶0.125 μl，混合使反应总体系为20 μl。放入46 ℃反应1.5 h，70 ℃变性15 min，冰上5 min后进行扩增。（3）PCR反应。在0.2 ml PCR管中加入1.2 μl逆转录产物、sd H2O 9 μl、10 mmol/L dNTP 0.24 μl、10×PCR缓冲液1.2 μl、聚合酶0.12 μl、上游引物（20 μmol/L）0.12 μl、下游引物（20 μmol/L）0.12 μl，总反应体系为12 μl。（4）PCR产物观察。PCR产物经40％丙烯酰胺凝胶电泳后，EB染色15 min，用凝胶成像系统进行拍照及图像分析，然后计算待测基因与内标磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH)吸光度的比值。PCR反应扩增参数如下：葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78, GRP78），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环22圈，72 ℃ 5 min；凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/EBP homologous protein, CHOP），94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环25圈，72 ℃ 5 min；GAPDH，94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环28圈，72 ℃ 5 min。引