志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析

【摘要】  目的 对志贺菌敏感株与诱导耐多株全菌蛋白进行蛋白质组学比较，寻找细菌耐多药相关蛋白。方法 采用4类抗生素的次抑菌浓度，对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验；对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳；电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析；差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MOLDI TOF-TOF质谱）分析。结果 成功获得志贺菌诱导耐多药株，在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出（946±37）个和（1096±189）个蛋白质斑点；共发现48个差异表达的蛋白点，其中5个质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白；其中前3个蛋白中在耐多药株中表达量增强，后2个减弱。结论 5个耐多药相关蛋白中在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调；ABC转运蛋白在志贺菌诱导耐多药机制中起重要作用。

【关键词】  志贺菌

　　近年来，随着抗生素的广泛使用甚至滥用，造成志贺菌频繁发生变异，产生耐药株，且耐药率高、耐药产生速度快、耐药范围广，给细菌性痢疾的防治带来新的挑战，因此，深入探讨志贺菌的耐多药机制成为目前解决志贺菌耐多药的先决条件。本课题选用对抗生素敏感的1株志贺菌，以自身药物诱导方式构建出多重耐药菌株，通过比较敏感株与药物自身诱导耐多药株蛋白质双向电泳图谱，观察与志贺菌耐多药相关蛋白，并对部分表达差异蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MOLDI TOF-TOF)分析和数据库检索,旨在探索其耐多药机制。结果报告如下。

　　1   与方法

　　11   材料

　　111   菌株   (1)福氏痢疾杆菌标准株：菌株号51571-9（中国药品生物制品检定所）； (2)敏感株：采用改良K-B纸片法，从临床分离鉴定的志贺菌株中，筛选1株对头孢噻吩(CF）、诺氟沙星（NOR）、庆大霉素（GM）、磺胺甲基异恶唑（SMZ）均敏感的福氏志贺菌作为敏感株。（3）诱导耐多药株：使用志贺菌标准株和分离出的敏感株，参考文献〔1〕的次抑菌浓度(1/2 MIC)诱导耐多药方法，建立诱导耐多药株。

　　112   试剂与仪器   头孢噻吩等抗生素均为标准品(中国药品中心)。固相pH梯度干胶条（immobiline pH gradient pH3～10,L=24cm ）；IPG缓冲液、IPG覆盖液、两性电解质pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-胆酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)- dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美国Amersham Pharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素（urea）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、蛋白酶抑制剂丙甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）(美国Sigma公司)。固相pH梯度等电聚焦仪IPGphor IEF System ,垂直板电泳仪、ImageScanner光密度扫描仪、图像分析系统（美国Amersham Pharmacia公司）。

　　12   方法 

　　121   蛋白质双向电泳   （1）蛋白提取方法：采用超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改进。（2）可溶性总蛋白定量：应用BradFord法〔3〕对提取的可溶性总蛋白进行定量；（3）第一相固相pH梯度等电聚焦:按文献〔4〕,程序分别为30V7h，60V7h，150V05h，300V1h，600V1h，8000V12h。（4）平衡：按文献〔3〕。（5）第二相垂直板SDS-PAGE电泳：按文献〔3〕。（6）染色：银染按Amersham Bioscience的银染方案稍作改进〔4〕。考马斯亮蓝染色按Neuhoff等的方法进行〔5〕。（7）图像扫描分析：用Amersham Bioscience的扫描仪投射扫描，分辨率为300dpi。数字化图像文件运用Image Master 2D Platinum软件分析。图像分析过程包括蛋白质斑点的检测、量化、背景扣除、匹配。蛋白质斑点经自动检测后进行手工校对，匹配之前先选一块胶作为参考凝胶，其他凝胶都与之匹配。

　　122   质谱分析   （1）质谱样品制备：比较双向电泳图谱，找到差异蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于15ml的Eppendorf管中,按文献〔6〕方法处理样品。(2)质谱鉴定:样品按照1∶1的比例,与含有α-氰基-羟基苯丙烯酸的50%乙腈/01%甲酸的溶液混合。所有质谱在4700 型MALDI TOF-TOF蛋白质分析系统下获得。选择反射式阳离子捕获方式，质量精确度为50mg/L;MS光谱质量范围800～4000Da。

　　123   数据库检索   光谱在全球蛋白服务工作站（Global Protein Server Workstation，GPS）进行处理和分析；搜索在NCBInr蛋白数据库进行；鉴定GPS可信区间应>95％。搜索参数设置：相对分子质量误差范围±20%，肽片段相对分子质量误差范围±05Da，每个肽允许有1个不完全裂解位点，物种选择细菌；蛋白质身份确定：根据搜索结果并结合蛋白质在凝胶上的等电点和相对分子质量进行最终确定；要求肽段覆盖率>15%，匹配肽段至少4个，等电点和相对分子质量与观察值基本相符。

　　2   结果

　　21   次抑菌浓度(1/2MIC)诱导耐多药结果    志贺菌出发菌的抑菌浓度（MIC）分别为头孢噻吩32mg/L，诺氟沙星05mg/L，庆大霉素2mg/L，磺胺甲基异恶唑512mg/L。将此出发菌在1/2MIC的LB培养基中传代，最终得到MIC≥4倍诱导前的耐多药菌株，分别是出发菌株的6，6，8，8倍。

　　22   蛋白质双向电泳图谱比较   (1)敏感株：相同实验条件及参数设置情况下,对志贺菌可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离，发现3次双向电泳图谱非常相似，蛋白质上样量为100μg，pH3～10,24cm线性干胶条通过Image Master 2D Platinum分析软件对其进行点检测，获得(946±37)个蛋白质斑点(图1)。(2)诱导耐多药株：对志贺菌诱导耐多药株可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离，获得3块凝胶的平均蛋白质点数为1096±189（图2）。经过背景消减后，将其中1块凝胶作为参考凝胶进行匹配，匹配点数为1078±26，其匹配率为9836％。

　　23   2种菌株蛋白质差异表达谱分析   以诱导耐多药株双向凝胶图谱为参考凝胶，与敏感株进行匹配，匹配蛋白质点数为637±16，匹配率为6879％，共发现48个差异表达的蛋白点(表达量相差5倍以上的点为差异蛋白质点)，其中8个蛋白点只存在于诱导耐多药株中，8个蛋白点只存在于敏感株中；在2种菌株中表达量相差5倍以上的32个蛋白点中，有26个蛋白点随着志贺菌由敏感株向耐多药株转变而表达量增加，其余6个蛋白点表达量下降（图3）。蛋白质上样量100μg;第一向pH3～10，24cm非线性干胶条； （科教范文网 lw.AsEac.com编辑整理）
第二向应用125%聚丙烯酰胺凝胶(银染)

　　图1   志贺菌敏感株蛋白质双向电泳图谱  （略）   

　　蛋白质上样量100μg;第一向pH3～10，24cm非线性干胶条；第二向应用125%聚丙烯酰胺凝胶(银染)

　　图2   志贺菌诱导耐多药株蛋白质双向电泳图谱（略）

　　图3   志贺菌敏感株与诱导耐多药株的差异表达蛋白（略）

　　24   质谱鉴定（表1）   在考马斯亮蓝染色的凝胶上选取5个差异点进行肽指纹图谱鉴定，结果可见，200，201，98号蛋白点表达量增加，72，14号表达量下降。

　　表1   差异表达蛋白的质谱鉴定结果（略）

　　3   讨论 

　　三磷酸腺苷-组合转运蛋白(ATP-Bmding cassettes transparters,ABC)外排系统为细菌耐多药主动流出机制之一，肿瘤细胞膜上此蛋白过量表达，以便药物顺利进入细胞并很快被泵出，形成多样抗药性〔7,8〕。陈川等〔9〕在研究嗜水气单胞菌耐四环素的蛋白质组学时发现，ABC转运蛋白在耐药株中表达量显著增加；Bories C等〔10〕在研究利什曼原虫的药物作用原理及抗药性中发现，ABC转运系统在利什曼原虫的抗药性中起重要作用；Sipos G等〔11〕也发现，ABC转运子在真菌的多药耐受性中起重要作用。本文结果显示，98号ABC转运蛋白(ATP binding cassette  transporter protei