春夏两季杨梅树叶部精油成分及抗氧化活性比较(2)

　　2.3.1 DPPH自由基清除率测定配制浓度分别为4，8，10，16，24，32 和50 g·L-1的受试样品甲醇液。分别取200 μl与4 ml浓度为6×10-5M DPPH甲醇液混合，于517 nm处测定吸光度，不加样的DPPH甲醇液为空白样。平行样为3个。自由基清除率按下式计算自由基清除率(%)=[(AC(0)–AA(t))/ AC(0)]×100%其中AC(0)为t = 0 h时的空白样吸光度值;AA(t)为t= 1 h时样品吸光度值。

　　2.3.2 β-胡萝卜素漂白试验法将β-胡萝卜素(0.1 mg)用氯仿(10 ml)于梨形瓶中溶解，加入亚油酸(20 mg)和吐温40(100 mg)，然后于50℃旋转真空干燥。加入50 ml含氧蒸馏水，于超声波中形成乳化液A。取200 μl浓度分别为4，8，12，16和20 g·L-1的受试样品乙醇液与5 ml乳化A液于试管中混合，不加样品的用等量乙醇代替与A液混合作为空白样。在50℃保温，于470 nm测定吸光度。平行样为3个。抗氧化率用下式计算抗氧化率(%) = [(AA(120) – AC(120))/( AC(0) – AC(120))]× 100%其中AA(120)为t = 120 min时的样品吸度度，AC(120)为t = 120 min时空白样吸光度值，AC(0)为t = 0 min时的空白样吸光度值。

　　2.3.3 硫代巴比妥酸法分别取0.1ml浓度为5，25，50 g·L-1的样品甲醇液与0.5 ml蛋黄乳浊液混合，加入50 L的AAPH自由基溶液(0.07mol/L)引发脂质过氧化反应。随后即加入1.5 ml乙酸溶液(20%)和1.5 ml浓度为0.8%硫代巴比妥酸液[用1.1% (W/V) 十二烷基硫酸钠溶液配制]，振荡均匀。不加精油样品的为空白样。然后于95℃水浴保持60 min。冷却后，每个试管中加入5 ml正丁醇，充分萃取，于1 200 g离心15 min。倾出有机层在532 nm处测定吸光度值。平行样为3个。抗氧化指数用下式计算抗氧化指数(%) =[(AC(0) – AA(t))/ AC(0)]× 100%其中AC(0)为空白样t = 0 h吸光度值，AA(t)为样品t = 1 h吸光度值。

　　2.4 数据处理与统计分析数据处理和统计分析采用SPSS10.0软件。相同受试浓度水平下各受试物的抗氧化率之间两两差异显著性分析比较用邓肯氏极差法(P<0.01)。

　　3 结果

　　3.1 精油的GC-MS分析采用水蒸气同步蒸馏法测得乌杨梅春季鲜叶精油含量为0.13%±0.04% (V/W)、夏季为0.05±0.01%(V/W)。精油均呈柠檬黄色，无刺激性，相对密度为0.9280 mg·ml-1。春、夏两季乌杨梅叶部精油的气相色谱总离子流图如图1所示。分别对2种精油中相对含量≥0.05%的41和36种成分进行了鉴定，被鉴定的组分相对含量总和分别为相应精油的97.30%和99.97%。结果见表1春、夏两季杨梅叶部精油的化学组分基本为倍半萜类(分别为92.77%和97.78%)。春季精油以倍半萜烯含氧衍生物为主(占52.69%)，而夏季精油则主要以倍半萜烯为主(占70.04%)。两季精油中化学组成没有明显变化，但其主要成分的含量存在较大差异。这种变化主要表现在：夏季精油中的倍半萜烯异石竹烯和石竹烯含量(分别为24.21%和26.47%)比春季精油明显高得多(分别为10.17%和11.61%)，而大根香叶烯A、α-依兰油烯、α-金合欢烯等倍半萜烯成分在两季节则变化不大;随着季节的更替，5-羟基白菖烯在鲜叶中的含量出现显著变化，其在春季精油中的含量高达30.44%，而夏季精油中的含量则仅为1.81%。此外，春、夏两季精油中均含有较高量的(E)- 橙花叔醇(分别为9.57%和16.65%)。

　　3.2 精油抗氧化性对比分析

　　3.2.1 DPPH自由基清除活性DPPH自由基清除法可适用于亲脂性和亲水性质子供体的活性检测。本研究选用脂溶性的BHT、弱脂溶性的PG和水溶性的抗坏血酸3个强抗氧化剂为参照，对比了春、夏两季乌杨梅叶部精油的DPPH自由基清除效果。如图2所示，BHT、PG和抗坏血酸均表现极强的DPPH自由基清除活性，三者在各受试浓度下的DPPH自由基清除率之间不存在显著差异(P≥0.01)。本实验测定它们的自由基半清除浓度IC50分别为0.014，0.018和0.013 g·L-1。总体而言，春、夏两季乌杨梅叶精油的DPPH自由基清除能力均随受试浓度升高而增强，春季叶部精油自由基清除活性表现优良，其IC50约为0.061 g·L-1，而夏季叶部精油DPPH清除活性较弱，在本实验条件下未能测出自由基半清除浓度，两季精油的DPPH自由基清除能力存在显著性差异(P<0.01)。DPPH自由基是依靠能抗氧化剂提供·H而中和的，作为灵敏的质子受体，通过观察质子供体与其反应的速度也能判断受试物抗氧化活性的强弱。在实验过程中也观察到，在相同浓度时春季杨梅叶部精油清除自由基的的反应速度比夏季精油反应速度快得多。导致这种现象的根本原因可能与5-羟基白菖烯在两季精油中的含量显著差异有关，作者曾测到从春季乌杨梅叶部精油中分离的5-羟基白菖烯单体具有极强的DPPH自由基清除能力[12]。A-春季样 B-夏季样图1 春、夏两季杨梅树叶部精油气相色谱总离子流图