穿心莲种子蛋白质电泳鉴定的初步研究(2)

　　1.3.1样品缓冲液的制备取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%(体积分数)的甘油5 mL、10%(体积分数)的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%(质量分数)溴酚蓝1 mL和蒸馏水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，备用。

　　1.3.2丙烯酰胺储存液100 mL(A液)30%丙烯酰胺、0.8%双丙烯酰胺。

　　1.3.34×分离胶缓冲液100 mL(B液)2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸馏水21 mL。

　　1.3.44×浓缩胶缓冲液100 mL(C液)取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸馏水46 mL，即得。

　　1.3.55%浓缩胶蒸馏水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%过硫酸铵30 μL，TEMED 5 μL。

　　1.3.612%分离胶A液4 mL，B液2.5 mL，蒸馏水3.5 mL，10%过硫酸铵50 μL，TEMED 5 μL。

　　1.3.7样品溶液的制备[8]取穿心莲种子0.5 g，加入稀释5倍的样品缓冲液(pH6.8)2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮(PVP)，冰浴下研磨，加入稀释4倍的5%浓缩胶缓冲液1 mL，振摇，混匀，超声20 min，室温离心20 min(4 000 r·min-1)。取上清液，离心20 min(4 000 r·min-1)， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振摇2 min，静止分层。吸取下层液体，加入适量冷丙酮，振摇，置4 ℃冰箱30 min，取出，离心5 s(4 000 r·min-1)，弃去丙酮，风干。沉淀物加入样品缓冲液2～3 mL，振摇2 min，超声5～10 min，待溶解完全后，室温下离心5 min(4 000 r·min-1)，取上清液，置4 ℃冰箱中存放，备用。

　　1.3.8电泳缓冲液的配制取Tris碱3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸馏水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，备用。

　　1.3.9电泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度12%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分别取样品液25 μL，注入样品槽底部，点样结束后向上槽内加入1滴溴酚蓝指示剂示踪。起始电压控制在120 V，样品进入分离胶后，电压调整为200 V，待指示剂距前沿约1 cm时，停止电泳，迅速取出胶板，标记前沿。

　　1.3.10染色和脱色取出胶板后，用蒸馏水冲洗，随即放入考马斯亮蓝 R250显色液中，置恒温箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更换脱色液(甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸馏水80 mL)，至背景清晰为止。拍照、记录。

　　2结果与分析