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研究局部应用GDNF对运动神经的保护作用

2014-04-05 01:00

摘要：　目的 研究周围神经损伤后，经蛛网膜下腔置管局部应用外源性胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line瞕erived neurotrophic factor，GDNF)对脊髓前角运动神经元的保护作用。方法 成年SD大鼠随机分为两组，即手术加生理盐水组和手术加GDNF组。切断大鼠坐骨神经致相应脊髓前角运动神经元损伤，于L5、6腰椎椎间隙行蛛网膜下腔置管，并注入外源性GDNF(10 μg/mL)，分别与术后4、8、12周行神经功能指数检测；于不同时间处死动物并取材，对L4～6节段脊髓标本冰冻切片，行尼氏体染色、光镜检查，并于术后12周取坐骨神经，行电镜检查并采用图象分析仪检测有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径。结果 GDNF组的坐骨神经功能指数、脊髓前角运动神经元的存活率、有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径均优于对照组，经统计学处理，两组差异有显著性(P＜0.05)。结论 通过蛛网膜下腔注入外源性GDNF保护相应的脊髓运动神经元的同时也促进外周神经功能的恢复。

关键词： 周围神经 损伤 运动神经元 胶质细胞源性神经营养因子

　.　　周围神经损伤可引起神经近端发生“轴突反应”，造成相应脊髓神经元胞体出现一系列形态、生化功能和代谢上的变化，严重时引起胞体的凋亡［1］。周围神经损伤后再生的先决条件是神经元胞体的存活及轴突的延伸，而后两者又有赖于微环境中神经生长因子的浓度。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line瞕erived neurotrophic factor，GDNF)是近年发现的重要神经营养因子(neurotrophicfactor，NTF)，是目前特异性最强的多巴胺能NTF，对运动神经元和感觉神经元均有强大的神经营养作用［2］。本实验旨在通过切断并显微吻合坐骨神经造成动物脊髓前角运动神经元损伤，经蛛网膜下腔置管局部应用GDNF，达到保护神经元以及促进神经再生的目的。 中国大学排名
　　1 材料和方法
　　1.1 动物及分组 SD雄性健康大鼠36只(山西医科大学动物实验中心提供)，体重250～300 g，随机分组：a)GDNF(购于美国Peprotech Asia公司)组18只，5％水合氯醛腹腔麻醉后，左侧坐骨神经于梨状肌下缘1 cm处切断，用9～0无创线缝合神经外膜。于L5、6椎间隙行蛛网膜下腔置管，于手术当天起通过留置管注入GDNF 6 μL(10 μg/mL)，连续注射10 d；b)生理盐水(NS)组18只，同法给予生理盐水6 μL。
　　1.2 实验标本制备 术后4、8、12周分别处死动物并取材。经左心室插管灌注多聚甲醛固定液后，取腰膨大脊髓(中心为L4～6节段)，－20℃连续冰冻切片，进行尼氏体染色(Thionine硫堇染色法)观察。
　　1.3 电镜检查 术后12周，将以横断处为中心的包括远近端各约2 cm长的神经取下，去除多余组织，固定于2.5％戊二醛中2 h，缓冲液冲洗，10％锇酸固定后，逐级酒精丙酮酸脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，醋酸铀饱和水溶液染色后再用枸橼酸铅染色，JEOL100型透射电镜观察。
　　1.4 图像分析及数据处理 切片经光镜检查照相及显微图像分析系统分析，计数脊髓前角大、中型运动神经元数目，对髓鞘进行定量测量。检测数据以(±s)表示，采用SPSS软件分析，不同时间点两样本均数比较进行t检验，组内不同时间点比较用SNK瞦检验。
　2 结 果
　　2.1 坐骨神经功能指数(sciatic function inders，SFI)测定 4周时，两组大鼠的坐骨神经功能指数无统计学差异，8、12周时，GDNF组SFI优于NS组，P＜0.05(见表1)。
　　2.2 尼氏体染色 本实验计数的神经元为位于脊髓前角外侧细胞核较大的中型神经元。脊髓前角运动神经元的存活率以手术侧与非手术侧同类神经元的数量相比表示，4周后，可见两组神经元的存活率存在显著性差异(见表2)。

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　　2.3 透射电镜观察结果 12周时，GDNF组：可见轴突及髓鞘成熟，髓鞘呈同心圆样排列，胞膜清楚，板层结构清晰，雪旺细胞增生活跃，胞浆内富含线粒体，髓鞘分布较均匀，形态及大小趋于正常。NS组：可见有髓纤维髓鞘薄，厚薄不均匀，髓鞘板层松散，密度不均，排列不规则，轴突直径较细，髓鞘受压变形。