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前列腺癌中基质金属蛋白酶7,9的表达及其与VE

2015-03-05 01:09
导读:药学论文毕业论文,前列腺癌中基质金属蛋白酶7,9的表达及其与VE在线阅读,教你怎么写,格式什么样,科教论文网提供各种参考范例: 作者:周洪澜 邢春伟 葛岩 王心蕊 王医术 【摘要】 目的 探
作者:周洪澜 邢春伟 葛岩 王心蕊 王医术
【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶7,9在前列腺癌转移侵袭中的作用,以及VEGF与基质金属蛋白酶的关系。方法 采用免疫组织化学和形态定量分析方法分析MMP7及MMP9表达情况,同时培养PC3M细胞并采用Boyden小室侵袭试验及酶谱分析观察MMP9及其与VEGF在前列腺癌中的作用。结果 前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P<0001)。Boyden小室侵袭实验显示,不同试验组穿透Matrigel的细胞数依次递减,即PC3M> PC3M MMP9Ab (1∶100)> PC3M MMP9Ab (1∶50),均有显坐的统计学差异(P<001)。酶谱分析观察发现,直接培养于培养皿表面的PC3M 细胞仅有稳定的MMP9和MMP2酶原表达,但PC3M细胞与VEGF共孵育组条件培养基中MMP9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加。结论 MMP7和MMP9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。VEGF与MMPs的分泌有关,其机制有待于进一步探讨。
【关键词】 前列腺癌;基质金属蛋白酶;血管内皮细胞生长因子
  基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)生物学效应贯穿于肿瘤发展的各个环节〔1,2〕。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种与肿瘤发生、发展密切相关的生长因子,可通过细胞内信号转导的级联放大效应而调节MMPs的产生与活化〔3,4〕,使得细胞外基质(ECM)处于不断地合成与分解代谢的动态平衡中,这种动态平衡的稳定是维持组织细胞结构和功能的重要基础。本研究以前列腺癌作为研究对象,探讨前列腺癌中金属蛋白酶与肿瘤转移侵袭的关系,以及金属蛋白酶和VEGF的关系。
  1 材料与方法
  11 材料

本文来自中国科教评价网


  所有前列腺癌材料取自手术切除的新鲜组织,共计34例,其中5例Gleason Grade 2,9例Gleason Grade 3,14例Gleason Grade 4,6例Gleason Grade5。5例正常前列腺组织取自意外死亡的正常男性青年。所有标本均经严格筛选并经病理诊断证实。体外培养前列腺癌细胞PC3M由吉林大学基础医学院病理生理学教研室惠赠;NIH3T3细胞由吉林大学第三临床学院中心实验室惠赠。
  12 免疫组织化学染色
  免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白补氧化物酶连接法(SP法)。所用一抗(MMP7,9,13)、二抗、三抗及DAB均购自迈新公司。步骤如下:梯度脱水、脱蜡,过氧化物酶(A液)阻断15 min,非免疫动物血清(B液)封闭;加入一抗,4℃过夜后;加生物素标记二抗(C液)30 min,滴加链亲和素补氧化物酶溶液(D液)30 min;DAB发色,水洗终止;苏木精复染细胞核,常规脱水透明,中性树胶封片。
  13 形态定量方法
  通过Cooled CCD采集预计数视野图片,而后采用Image睵ro Plus Analysis Software分析表达阳性的切片。
  14 细胞培养
  在含10%新生牛血清和抗生素的IMDM培养液中培养人前列腺癌细胞PC3M。
  15 Boyden小室肿瘤侵袭试验
  NIH3T3条件培养液的制备:铺Matrigel基膜胶,收集前列腺癌细胞,向小室上室内加入100 μl癌细胞悬液,于37℃,5%CO2条件下孵育4~6 h,醋酸簿凭布兹┕潭ㄒ汗潭20 min,HE染色,中性树胶封片。侵袭细胞的计数:在400×视野下任取10个不重复视野,利用目镜测微尺计数每个视野穿透Matrigel基膜胶下室面的肿瘤细胞数目,计算平均值。
  16 酶谱分析
  酶谱分析基本步骤:配制含1 mg/ml明胶的10%SDS睵AGE底物;将已制好的浓缩蛋白样品不经加热直接上样;以5 mA/gel电泳,当样品进入分离胶后,将电泳电流提高到10 mA/gel;电泳完成后,将底物胶置于孵育缓冲液中37℃缓慢摇摆18 h,以使待测MMPs充分作用于底物;孵育结束后经考马斯亮蓝染色30 min及脱色液(45%甲醇,10%冰乙酸)脱色60 min,观察结果。利用图像分析软件对酶谱分析结果进行灰度扫描。利用紫外分光光度法测蛋白质含量,每组细胞设3个平行样本,组织酶谱分析重复多次观察。具体步骤:电泳、封胶后,利用图像分析程序,读取图像反转膜式后各消化条带的灰色度及面积,计算各条带的酶含量。酶含量=条带面积×(条带灰度减于背景灰度),将所得值再换算成单位蛋白表达量作为最终测得的酶含量值,从而对各组细胞的酶活性进行定量比较。
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