疏肝活血法对下肢缺血模型大鼠血管内皮祖细胞

【摘要】 【目的】观察疏肝活血法对下肢缺血模型大鼠外周血管内皮祖细胞(EPC)的影响。【方法】将50只SD大鼠随机分为3组：中药组20只，模型组20只，假手术组10只。中药组和模型组均采用右下肢股动脉结扎及分支剔除术复制大鼠下肢缺血模型,假手术组仅暴露股动脉但不结扎股动脉及其分支。中药组术后按05 g·kg-1·d-1剂量灌服柴胡疏肝散合大黄虫丸煎剂,连续7 d。检测各组术前1 d、术后第1、3、7天4个时间点大鼠外周血酶学指标肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、α掺嵌∷嵬亚饷(HBDH)水平变化及双荧光阳性细胞[CD34+、血管内皮生长因子受体(VEGFR+2)]比例。【结果】术后模型组外周血酶学指标AST、CK、LDH、HBDH水平较假手术组均显著上升,术后第3、7天中药组各项酶学指标水平较模型组及术后第1天均显著下降(P<005)。术后中药组和模型组反映EPC变化的CD34+、VEGFR2+双荧光阳性细胞比例较假手术组均显著升高(P<005),且中药组升高较模型组更为显著(P<005或P<001)。【结论】疏肝活血法可有效地改善下肢缺血状态，其作用可能与其能增加外周血EPC数量有关。

【关键词】 疏肝活血法/治疗应用;下肢缺血/中药疗法;血管内皮祖细胞/血液;疾病模型，动物;大鼠

下肢缺血性疾病是指因动脉狭窄或闭塞而引起的一系列疾病,其典型的症状为间歇性跛行,严重者会出现缺血性静息痛、肢端缺血性溃疡和坏疽,甚至导致截肢,严重影响患者生活质量。现代研究表明,血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)等细胞因子,可促进缺血组织的血管新生和侧枝血管形成,进而促进缺血组织的修复[1-2],为缺血性疾病的深入研究提供了新的思路。前期研究显示：中医疏肝活血法对治疗下肢缺血性疾病有确切的疗效[3],但其治疗机理目前尚不明确。本研究尝试从血管新生的角度探讨中医疏肝活血法对促进缺血肢体修复的可能作用机制。现报道如下。

　　1材料与方法

　　11实验动物SD大鼠(SPF级)50只,雌雄不拘,体质量250~300 g,购自广东省实验动物中心,合格证号：SCXK(粤)20030002,粤监证字2008A020。

　　12主要试剂与仪器异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体(由美国Santa Cruz公司生产,批号：B1208)，藻红蛋白(PE)标记的抗大鼠白细胞分化抗原34(CD34)单克隆抗体(由美国Santa Cruz公司生产,批号：C1108)，IgG1睩ITC同型对照抗体(由美国Molecularp Robes公司生产,批号：53419A)，IgG1睵E同型对照抗体(由美国Santa Cruz公司生产,批号：E3008)，红细胞裂解液由广东省中医院中心实验室提供。FC500 流式细胞仪由美国贝克曼—库尔公司生产，7180型全自动生化分析仪由日本日产公司生产。

　　13中药制备柴胡疏肝散(陈皮6 g、柴胡6 g、川芎6 g、香附6 g、枳壳6 g、芍药9 g、炙甘草3 g)合大黄虫丸(国药准字：Z32021248),由广东省中医院实验动物中心制备,将其浓缩成05 g/mL,高压灭菌,4℃ 冰箱保存备用。

　　14模型制备[4-5]与分组实验动物随机分为3组,中药组20只,模型组20只,假手术组10只。以100 mg/L水合氯醛(35 mL/kg)行大鼠腹腔注射麻醉,选右侧腹股沟中点向膝部作一长度约2 cm的纵行切口,紧贴腹股沟下方分离股动脉主干,中药组和模型组行右下肢股动脉结扎及分支剔除术,复制下肢血管缺血模型，假手术组仅暴露股三角,不结扎股动脉及其分支。中药组术后按照05 g·kg-1·d-1剂量灌服制备药物,连续7 d。模型组和假手术组不予给药。3组大鼠实验期间未出现死亡及下肢缺血坏死情况。

　　15观察指标

　　151酶学检查设置术前1 d,术后1、3、7 d共4个时间点,各组在对应时间点经眼眶静脉丛采全血各1 mL,血标本由广东省中医院检验科统一检验,采用酶动力学法检测外周血肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、α掺嵌∷嵬亚饷(HBDH) 、谷草转氨酶(AST)水平。

　　152CD34+、VEGFR2+的测定按151项下相同时间点采样,采用双色荧光标记流式细胞检测法,观察大鼠外周血双荧光阳性细胞(CD34+、VEGFR+2)比例的变化。具体方法： 每只大鼠各设置1个测定管与同型对照管,每管取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血50 μL;测定管加FITC标记的抗大鼠VEGFR2单抗和PE标记的抗大鼠CD34单抗各20 μL,同型对照管加相应的2种同型对照抗体,室温避光孵育15 min; 每管加500 μL红细胞裂解液,室温避光孵育20 min;各管加1 mL流式细胞检测缓冲液,1 500 r/min离心5 min,弃上清; 加磷酸盐缓冲液(PBS)300 μL重悬,上机检测。以488 nm氩离子激光激发,每次计数10 000个细胞,用Cellquest软件分析双荧光阳性细胞所占比例。每个标本中测定管的双荧光阳性细胞比例减去对照管的双荧光阳性细胞比例,即为该标本实际的双荧光阳性细胞比例。

　　16统计学方法采用SPSS 130统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，方差不齐采用秩和检验，检验水平α=005。

　　2结果