评价网 > 科教论文 > 医学毕业论文 > 临床医学论文 > 正文

“失血休克-内毒素”二次打击所致肺损伤水通道

2014-07-12 01:05 毕业

【摘要】 目的 探讨水通道蛋白(AQP)－1和AQP－5在失血性休克-内毒素2次打击所致大鼠肺损伤中的表达。方法 30只SD大鼠随机分为2组：假手术对照组（C组）、2次打击组（HS组），每组15只。建立“未控制性失血休克－内毒素” 2次打击大鼠模型，并按院前期90min、院内复苏期60min、院内观察期3期进行实验。实验结束前采血测动脉血气并比较2组大鼠存活率。测定肺泡灌洗液（BALF）蛋白（BALFpro）、肺通透指数（PPI）及肺组织湿/干重量比(W/D)；HE染色光镜下观察肺损伤程度；采用免疫组化分别测定肺组织AQP-1和 AQP-5的蛋白表达。 结果 与C组比较，HS组MAP、lac、PaO2、pH、BE、PPI、BALFpro、W/D等指标均明显恶化，肺组织损伤严重，大鼠存活率降低；与C组比较，HS组肺组织AQP-1和 AQP-5的表达显著降低(P <0.01)。结论 2次打击所致大鼠肺损伤时AQP-1和 AQP-5表达均明显降低，这可能是失血性休克后肺损伤肺水肿形成的重要原因之1。

【关键词】休克；失血性； 水通道蛋白－1；水通道蛋白－5
Decreased expression of aquaporin 1 and aquaporin 5 in uncontrolled hemorrhagic shock induced acute lung injury in a two-hit model in rats.
GAO Ju, ZHAO Wei-xian，XU Shao-qun, et al. Department of Anesthesiology, Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, 510120, China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of aquaporin1and aquaporin5
in hemorrhagic shock induced acute lung injury in a two-hit model of hemorrhagic shock followed by mimicked infection. Methods Thirty SD rats were randomly assigned to the following two groups：control group(C group，surgery, no hemorrhage, and no resuscitation), two-hit model group (HS group). We used three-phased uncontrolled hemorrhagic shock model in rats. Hemorrhagic shock phase I began with blood withdrawal over 15 min, animals were subjected to massive hemorrhage [mean arterial pressure (MAP) = 35～ 40 mmHg for 60min and followed by intratracheal lipopolysaccharide 2 mg/kg (two-hit model). At hemorrhagic shock 90 min, resuscitation phase II of 60 min began with hemostasis, return of all the blood initially shed, plus fluids. Observation phase III was to 3.5h. After phase III, arterial blood gas and survival rates were recorded. Lung tissue was sampled to measure values of wet-to-dry lung weight ratio(W/D), pulmonary permeability index (PPI), BALF protein, and immunohistochemical used for detection of expression of AQP1and AQP5 . Results Compared with the control group, the HS group significantly decreased survival rates and increased pulmonary microvascular permeability and wet-to-dry lung weight ratio, and also decreased the AQP1and AQP5 expression in lung tissue. Conclusions These findings showed that the expression of AQP1 and AQP5 may play an important role in abnormal fluid transportation and formation of pulmonary edema in uncontrolled hemorrhagic shock –induced ALI.

（科教作文网http://zw.nseAc.com）

【Key Words】Hemorrhage; Shock; Resuscitation; aquaporin

失血性休克并发急性肺损伤（ALI）的发生率高达40%[1]，其主要机制与肺内液体的渗出与清除失衡有关。水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是1组对水特异通透的膜蛋白分子，新近发现其与感染所致肺损伤、肺水肿及其严重程度密切相关[2]。但目前尚不明确失血性休克所致早期肺损伤是否与AQPs有关。因此，本研究通过建立“未控制性失血休克-内毒素” 2次打击大鼠模型，重点观察AQP1和AQP5在2次打击所致急性肺损伤时的表达变化，探讨此类急性肺损伤时肺水肿形成的机制。

材料与方法
动物分组和模型制作 健康成年清洁级SD大鼠30只（广州中医药大学实验动物中心提供），体重250～280g，动物实验前12h禁食、4h禁水，腹腔注射10％水合氯醛（0.3ml/kg）麻醉，将大鼠4肢及头部固定于恒温操作台上，颈部备皮后用碘伏消毒，分离右颈总动脉和静脉，分别插管作动脉压监测和放血、采集血标本和输液。稳定15min后测定基础值。完成上述操作后，将大鼠随机分2组:即假手术对照组（C组）、2次打击组（HS组），每组15只。
未控制性失血性休克动物模型：参照文献[3]的方法制作，略有变动。该模型分以下3期：(1)院前期（简称院前）：时间为90 min，C组不放血，HS组通过颈总动脉放血，在15min内将大鼠血压降至40mmHg，并将放出的血液保存于干燥的肝素抗凝试管中，记录放出的血液容积。维持休克状态60 min，其间若MAP超过40mmHg，则放出部分血液；若MAP低于35mmHg时，则回输部分失血。2次打击：在维持休克状态60 min后，明视下气管内注射内毒素 (Lipopolysaccaride，sigma公司，美国)2mg/kg，同时用碘伏消毒尾巴，在鼠尾部远端3分之1处断尾，造成活动性出血并持续30 min，同时用无菌干燥的肝素抗凝试管收集流出的血液。 (2)院内复苏期（简称院内）：结扎尾部断端止血，并记录出血量。HS组在1h内回输全部采集的血液及等量平衡液。(3) 院内观察期（简称院观）：血液回输结束后，继续观察3.5小时，并分别在观察期的1、2和3.5h记录血压，心率和呼吸频率。实验结束后立即采血测动脉血气，并处死尚存活的大鼠，打开胸腔，结扎左主支气管，剪左上肺组织，立即置于液氮罐中-180℃保存，用作RT-PCR检测。取左中肺用体积分数为10％的多聚甲醛固定，用作HE染色和免疫组化。左下肺称量，用于测定W/D。将1塑料导管插入右主支气管后结扎固定在右主支气管上，缓慢注入2ml含肝素生理盐水，用注射器反复轻柔抽提并轻轻晃动肺组织获取支气管肺泡灌洗液（BALF）。灌洗3次，记录回收量，离心取上清注入肝素抗凝管中保存待测。 （转载自http://zw.NSEAC.com科教作文网）
观察指标与测定方法
(1)观察大鼠不同时点MAP的变化。
(2)实验结束时用i-STAT血气分析仪测定大鼠动脉血气。
(3)肺组织湿/干重量比(W/D)、肺泡灌洗液（BALF）中蛋白（BALFpro）、及肺通透指数（PPI）的测定：实验结束后取左下肺称湿重量, 然后置烤箱(80℃,20ｈ)烤至恒重,称干重,分别计算W/D。 溴甲酚氯法测定血浆及BALF中蛋白含量,计算PPI。
(4)AQP-1和AQP-5检测：滴加1：200兔抗鼠AQP-1和 AQP-5多克隆抗体(Santa Cruz biotechnology, 美国)，4℃过夜。2抗为生物素化的抗鼠IgG,之后过程按SABC试剂盒(中山生物技术公司产品公司，北京)说明进行,ＤＡＢ显色。用HPISA－2000型全自动图象分析仪分析结果，测定AQP-1和 AQP-5的表达和定位。
(5)肺组织镜检:石蜡包埋切片后常规苏木素－伊红（HE）染色，光镜下观察肺损伤的程度。
(6)比较2组大鼠的生存率。

统计学处理 各组数据以（X±S）表示，采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析（ANOVA）及LSD检验。Kaplan－ Meier 方法比较各组死亡率。Ｐ<0.05为差异有显著统计学意义。
结 果
动脉血气变化 实验结束时HS组的血气值乳酸（lac）、pH、PaO2、 HCO3- 、BE 及SaO2等均明显异常，与C组比较差异有统计学意义(P <0.01)。见表1。
肺血管通透性指标变化 与C组比较，HS组的W/D、PPI和BALF（Pro）值显著增高(P<0.01)，见表2。
AQP-1和AQP-5表达与定位 C组AQP-1和AQP-5呈高水平表达，其中AQP-1主要定位于肺血管内皮，呈棕黄色染色强阳性表达，AQP-5主要定位于肺泡上皮，也呈棕黄色染色强阳性表达，而HS组AQP-1和AQP-5的表达均较C组明显减弱，表现在定位于肺血管内皮和肺泡上皮的棕黄色染色减浅。见图1（a～b）和图2（a～b）。
肺组织病理 光镜下C组肺组织结构完整，肺泡隔无水肿、炎症，肺泡腔清晰；HS组肺泡间隔增宽，肺泡壁结构破坏，伴局灶性肺不张,血管周围及肺泡腔内有大量炎性细胞浸润和渗出液；见图3（a～b）。
2组生存率 C组100%、HS组58.3%。与C组比较，HS组生存率明显降低(P <0.01)。

讨 论
创伤失血性休克是临床上常见的急危重症，也是目前1～40岁人群组的首要死亡原因。创伤后死亡1般有3个高峰，第1高峰在创伤瞬间，死亡约50%，第2高峰在伤后几分钟到1个小时内，主要死于失血性休克，第3个死亡高峰在院内治疗后期，与并发ARDS和MODS有关。后者成为休克复苏失败和病人最终死亡的主要原因。
本研究通过建立模拟临床的“2次打击”大鼠模型，即通过第1次打击(严重失血休克等)激发引起机体SIRS，在此基础上第2次打击(创伤后感染、不恰当的复苏等)引发SIRS失控导致ALI。其优点是与临床ALl的病理生理过程10分接近。既往研究显示，血乳酸是评估组织低灌流程度的敏感指标，目前已成为评估休克严重程度的重要指标之1。脓毒性休克患者血乳酸水平与预后密切相关，血乳酸清除率每降低10%，死亡率即增加11%[11]。本研究结果表明，2次打击组大鼠的死亡率较高，其原因可能与大鼠经历“失血性休克-内毒素” 2次打击后血乳酸水平急剧升高有关。
既往研究证实，失血性休克后即使无感染也易并发急性肺损伤，发生率可达40%[1]，其原因与肺内液体渗出与清除失衡有关。对此以往1直关注肺血管通透性的改变，而对AQPs的液体转运功能在肺损伤和肺水肿形成中的作用尚缺乏认识。目前仍不清楚失血性休克早期出现的肺损伤以及水的跨膜转运异常是否与AQP有关。
自1992年 Preston等[12] 首次在Science 杂志上报道水通道蛋白以来, 已证实水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是1组对水特异通透的膜蛋白分子，无论在生理或病理状态下对肺内的水平衡调节发挥重要作用。实验显示，敲除AQP-l基因小鼠的肺泡-毛细血管水通透性可降低l0倍[13,14]，同时敲除AQP-l、 AQP-5基因小鼠的水通透性甚至可降低25～30倍[15]。且近年的研究表明AQP-l、 AQP-5参与了多种肺损伤后肺水肿的病理过程[2,16,17]，其中AQP-l主要定位于肺微血管内皮，主要功能是清除支气管和血管周围组织的水份， AQP-5位于Ⅰ型肺泡膜，主要清除肺泡腔内水份。
本研究发现失血性休克和内毒素刺激下大鼠肺组织AQP-l和AQP-5的蛋白表达水平明显下调，肺组织损伤严重，提示2次打击后机体清除肺间质和肺泡腔过多水分的能力明显减弱，肺泡-毛细血管膜水通透性显著降低。 与此相对应，该组肺组织含水量也显著增加。
综上所述，“2次打击”大鼠肺组织AQP-1和AQP-5表达显著下调，并且其表达水平可能与肺水肿和肺损伤的严重程度密切相关。因此对于失血性休克所致肺损伤如能有效调控AQP-1或AQP-5的表达，无疑将有助于肺泡腔和间质水肿液的吸收，减轻肺水肿和肺损伤的发生，可能有利于改善失血性休克患者的预后。

参 考 文 献

1. Maeshima K, Takahashi T, Uehara K, et al. Prevention of hemorrhagicshock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochem Pharmacol, 2005, 69:1667-1680.
2. J IAO Guangyu, LI Erran YU Runjiang. Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lungs in rats. Chinese Medical Journal, 2002, 115: 963-967.
3. Capone AC, Safer P, Stezoski W, et a1．Improved，outcome with fluid restriction in the treatment of uncontrolled hemorrhagic shock. J Am Coll Surg，1995, 180:49-56.
4. Kiraly LN, Differding JA, Enomoto TM, et al. Resuscitation with normal saline (NS) vs. lactated ringers (LR) modulates hypercoagulability and leads to increased blood loss in an uncontrolled hemorrhagic shock swine model. J Trauma. 2006, 61:57-64.
5. Fujiyoshi N, Deitch EA, Feketeova E, et al. Amiloride combined with small-volume resuscitation with hypertonic saline is superior in ameliorating trauma-hemorrhagic shock-induced lung injury in rats to the administration of either agent alone. Crit Care Med, 2005, 33:2592-2598.
6. Pascua JJL, Ferri LE, Seely AJE, et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishies neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Ann Surg, 2002, 236:634
7. Mauritz W, schimetta W, Oberreither S, et al. Are hypertonic hyperoncotic solutions safe for prehospital small-volume resuscitation? Results of a prospective observational study. Eur J Emerg Med, 2002, 9:315-319.

（科教作文网http://zw.ΝsΕac.cOM编辑）

8. Bahrami S, Zimmermann K, Szelenyi Z, et al. Small-volume fluid resuscitation with hypertonic saline prevents inflammation but not mortality in a rat model of hemorrhagic shock. Shock, 2006, 25:283-289.
9. Lv R, Zhou W, Yang JJ, et al. Hydroxyethyl starch inhibits intestinal production of cytokines and activation of transcription factors in endotoxaemic rats. J Int Med Res. 2005, 33:379-88.
10. Tian J, LinX, GuanR, et al. The effects of hydroxyethyl starch on lung capillary permeability in endotoxic rats and possible mechanisms. Anesth Analg, 2004, 98:768-774.
11. Nguyen HB, Rivers EP, Knoblich BF, et al.

[1]