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1 引言 目前，生物修复被认为是最为经济有效的(2)

2013-05-10 01:02
　　2.2.3 NaN3 抑制条件下，菌种运输富集正十六烷的试验
　　微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。培养液以6000r/min 离心5min，然后菌体用5mL 灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到正十六烷培养基（DQ01 和DQ02 中正十六烷的浓度分别为20 mg·L-1）中， 30℃，150r/min 培养25min，其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3，分别在1min，4min，5 min，8min，10min，14min，18min，25min 取出5mL 细菌离心，菌体用无机盐培养基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2 次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以去除吸着在表面的烷烃，收集清洗液，测定上清中正十六烷的浓度变化。然后重悬于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超声破壁，每次3s 共60 次，每次间隔7s， 离心分离(7000r/min,10min)，上清液用等体积正己烷超声萃取2 次。收集有机相，并用无水硫酸钠脱水，在旋转蒸发定容到1mL，用GC 测定菌种体内的浓度。
　　2.2.4 超薄切片的制备和微生物体内包涵体的观察
　　参考 Preusting H [12]所用方法：将生长48h 的微生物离心后，倒去上清，2.5％戊二醛固定4h，PBS 缓冲液冲洗3 次，1％锇酸固定2h，PBS 缓冲液冲洗3 次。然后分别用30%、50%、70%、80％、90％、95％、100％乙醇脱水，每次15min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按3?1 比例混合，放入样品，静置60min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按1?1 比例混合，放入样品，静置60min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按1?3 比例混合，放入样品，静置60min。将样品放入EPON812 树脂，静置60min。将样品用EPON812 树脂包埋剂进行包埋，60℃下放置24h。将聚合好的包埋块修块、超薄切片，然后醋酸双氧铀染色30min，柠檬酸铅染色30min，最后进行电镜观察。对电镜内细胞中包涵体物的情况进行分析。对照是用葡萄糖培养基培养的2 种菌种在培养48h 后用上面的步骤处理。
　　2.2.5 GC 条件
　　采用 Varian3800 气相色谱仪，色谱柱为HP-SE-54(30m，0.25mmid),载气（N2）流速为16-20cm/s，进样口分流比为60?1，进样口温度为250℃，FID 检测器温度为300℃，柱温100℃保持2min，并以10℃/min 升温到250℃保留10min。
　　3 结果与讨论
　　3.1 不同正十六烷浓度对菌种运输富集的影响
　　从图可看出，蜡状芽孢杆菌DQ01 和芽孢杆菌DQ02 体内富集正十六烷的含量随初始培养液中正十六烷浓度的增加而增加，且在各个浓度水平上，DQ01 细胞内富集的正十六烷量高于DQ02 体内正十六烷的富集量，说明在实验浓度范围内，2 菌株细胞外正十六烷浓度的增大可以加大2 株菌对正十六烷的运输富集。如当培养液中正十六烷初始浓度为20 mg·L-1时，20min 后，进入DQ01 细胞内的正十六烷浓度为2.76 mg·L-1，而当培养液中正十六烷初始浓度为40 mg·L-1 时，进入DQ01 细胞质中的正十六烷浓度为5.22 mg·L-1。原因为，正十六烷的浓度增大，加大了微生物对有机底物的接触几率，从而增加了进入细胞内的有机物的含量。但随着初始正十六烷浓度的增加，细胞质中富集的正十六烷含量趋于稳定，如正十六烷初始浓度分别大于50 mg·L-1 和30 mg·L-1 时，DQ01 和DQ02 细胞内富集的正十六烷增加缓慢，可见，正十六烷降解菌细胞膜内富集底物的能力与有机底物的初始浓度有关，这一现象与Kappeli.O 研究结果一致[13]。随着培养液中正十六烷含量的增加，微生物DQ01 和DQ02并没有表现出中毒性状，2 株菌体内富集的烷烃量反而增加，这是因为微生物通过调节细胞膜的流动性和细胞膜中不同脂肪酸含量比例来适应毒性逐渐增加的环境，并发挥对有机底物的降解功能[14]。随着培养液中烷烃含量的增加，细胞膜中顺式和反式不饱和脂肪酸的比例降低，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比例的增加都能增大细胞膜的流动性，从而弥补了有机物对微生物产生的毒性效应[15-16]，因此仍需深入分析DQ01 和DQ02 细胞膜中以及膜内不同脂肪酸的组成比例，从而更好地掌握微生物对烷烃的运输机制。