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3 结果
3.1 pET-14b-SBP-HMGB1 重组质粒的鉴定
为了鉴定构建的重组质粒是否正确,将提取的质粒pET-14b-SBP-HMGB1 分别用Kpn I和Xho I 进行双酶切。电泳结果表明,经双酶切后可得到约4.8 kb 和645 bp 的片段,符合预期大小。而用特异性引物进行PCR 反应扩增后在600-700 bp 之间出现与预期相符的结果。测序结果(用T7 promoter primer 和T7 terminator primer 双向测通)证实插入到pET14b-SBP-EGFP 载体中的目的片段是正确的。
3.2 His-SBP-HMGB1 融合蛋白的诱导表达及纯化
将重组正确的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG 诱导后,细菌裂解液在约33 kD处形成一条浓密的蛋白条带,与预期的His-SBP-HMGB1 融合蛋白大小一致。利用Ni2+-NTA亲和层析法对细菌裂解液进行纯化后,在33 kD 处得到一条高纯度的蛋白条带。
4 讨论
高迁移率族蛋白由Johns 在20 世纪60 年代发现,其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名。HMGB1 于20 世纪70 年代在小牛胸腺中作为染色质蛋白被发现,是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白染色质蛋白,作为核DNA 结合蛋白参与稳定染色质结构与功能和基因转录调控。HMGB1 含有2 个约80 aa 组成的HMG 框,分别是位于N 端A 框(1~85 aa)和位于分子中间的B 框(88~162 aa),是结合DNA 的功能结构域。
HMGB1 作为一种细胞因子是一种重要的晚期炎症介质,也是一个重要的肿瘤调节基因,在多种人类肿瘤组织中过量表达。其生物学活性主要是通过与其相应受体的相互作用而实现,其中RAGE 是HMGB1 的主要受体,通过与HMGB1 高亲和力结合,参与免疫应答等生理、病理过程,如通过激活p38 MAPK,p44/p42 MAPK,SAPK/JNK 信号通路促进细胞的生长、分化成熟。Dumitriu 等报道树突状细胞通过释放HMGB1 作用于RAGE 受体控制T 细胞活化;用RAGE 中和抗体和RAGE 缺失的细胞,发现RAGE 是HMGB1 在树突状细胞发挥效应所必需的。Park 等报道,HMGB1 依赖Toll 样受体(Toll like receptor,TLR),包括TLR4 和TLR2,介导的信号通路来激活NF-κB。然而Kokkola 等等用TLR2 基因敲除小鼠研究发现HMGB1 激活的巨噬细胞分泌的TNF 并未受影响,所以,TLR 作为HMGB1的膜受体参与NF-κB 信号转导仍然存在一定的争议。
(转载自http://www.NSEAC.com中国科教评价网)