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1 引言 人的高迁移率族蛋白1(high mobility group box

2013-05-11 01:01

　　1 引言

　　人的高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1) 含215 个氨基酸残基(aminoacid, aa)。最初发现的HMGB1 是一种广泛存在的DNA 结合蛋白，它参与DNA 的转录、复制、修复以及细胞运动等。HMGB1 作为一种细胞因子，是一种重要的晚期炎症介质，是引起败血症的重要原因。HMGB1 在多种肿瘤中过表达，其水平远高于相对应的正常组织，且可能与肿瘤的发生发展、病灶大小、浸润及淋巴转移有密切关系。目前，普遍公认的HMGB1 结合的膜受体是晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation endproducts, RAGE）。但研究发现细胞表面可能还存在着其他HMGB1 受体，这表明HMGB1作用于细胞可能存在不同的信号转导方式。为进一步研究清楚HMGB1 作用于细胞的信号机制，本文章构建了His-SBP-HMGB1 融合蛋白表达载体，为下一步通过串联亲和纯化来寻找与HMGB1 蛋白相互作用的蛋白提供实验材料，为深入研究HMGB1 的细胞信号转导通路机制提供实验工具。

　　2 材料与方法

　　2.1 质粒
　　pET-14b-SBP-EGFP 和pET-14b-HMGB1-EGFP 载体、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)均由本室保存。

　　2.2 主要试剂
　　引物由上海英骏生物技术有限公司合成。限制性内切酶(Kpn I、Xho I)、T4 DNA 连接酶均购自TaKaRa 公司；高保真DNA聚合酶KOD plus、100 bp 和1 kb DNA ladder 分别是Toyobo公司和Axygen 公司产品；异丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG）购自Sigma-Aldrich 公司；QIAprep Spin Miniprep Kit 和Ni2＋-NTA 亲和树脂购自Qiagen 公司；苯甲磺酰氨 (phenylmenthylsulfonyl fluoride, PMSF)、Triton X-100 和蛋白酶抑制剂混合物（cocktail of proteases inhibitor）购自美国Sigma 公司；青霉素钠、链霉素、EDTA 及其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　2.3 pET-14b-SBP-HMGB1 重组质粒的构建

　　利用 PCR 技术以pET-14b-HMGB1-EGFP 为模板，扩增HMGB1 全长编码序列。使用的上游引物为5′CAT GGTACC GGC AAA GGA GAT CCT AAG AAG C 3′（下划线为Kpn I 位点）；下游引物为5′CCCG CTCGAG TTA TTC ATC ATC ATC ATC TTC TTC TTC 3′（下划线为Xho I 位点）。用高保真DNA 聚合酶KOD plus 进行聚合酶链反应（polymerase chainreaction，PCR）扩增（反应条件为94 ℃，15 s；56 ℃，30 s；68 ℃，1 min，35 个循环），扩增片段大小为645 bp。将PCR 产物和载体pET-14b-SBP-EGFP 分别用Kpn I 和Xho I 双酶切并电泳切胶回收后，用T4 DNA 连接酶连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5α。
　　挑取单菌落接种于Amp+的LB 培养基中，37 ℃振摇过夜。取5 ml 菌液用QIAprep SpinMiniprep Kit 小量提取质粒后，用Kpn I 和Xho I 酶切鉴定。另外使用上述引物对重组体进行PCR 鉴定。酶切及PCR 鉴定产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。重组体最终经测序鉴定无误后，置-20℃保存备用。

　　2.4 His-SBP-HMGB1 融合蛋白的原核表达及纯化
　　将阳性重组质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)。挑取单菌落，置于2 ml LB(Amp+)培养基中，37 ℃振摇培养至D600 约为0.6 时，加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 诱导，继续振摇3h。利用12% SDS-PAGE 来鉴定表达融合蛋白的菌落。对高效表达His-SBP-HMGB1 融合蛋白的细菌，扩增到500 ml 体积并进行IPTG 诱导。8,000×g, 4°C 离心5 min，收集细菌并重悬于8 ml 结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCL, 500mmol/L NaCl, 5 mmol/L 咪唑，pH 8.0）在冰上超声裂解细菌，14,000×g，4℃离心30 min，收集上清，将上清转入装有Ni2+-NTA 亲合树脂的层析柱中，并让其自然流出，然后用5 ml结合缓冲液洗去未结合蛋白，再用5 ml（1 ml/次）冲洗缓冲液（20 mmol/L Tris-HCL, 500mmol/L NaCl, 20 mmol/L 咪唑, pH 8.0）洗涤非特异结合蛋白，最后用3 ml 洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L NaCl, 400 mmol/L 咪唑, pH 8.0）洗脱His-SBP-HMGB1 重组蛋白，用12% SDS-PAGE 鉴定结果。