应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光(2)

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　试剂　4,7二氯磺苯基1，10啡罗啉2，9二羧酸［4,7瞓is(chlorosulfophenyl)1,10瞤henanthroline2,9瞕icarboxylic acid,BCPDA自制］；纯化亲和素(Streptavidin，SA ，Sigma公司)；硫代琥珀酰亚氨6生物素氨基布乎ダ啵跾ulfosuccinimidyl6'(biotinamido)6 hexanamido hexanoate，Sulfo睳HS睱C睱C睟iotin， pierce Chemical Company］；聚乙烯胺氢氯化物(Polyvinylamine hydrochloride， PVA,Chemical Dynamics Corp) ；硼酸钠、二甲亚砜(天津化学试剂有限公司)；单克隆抗体根据文献［5］选择Hyb234—5(Statens serum Institut)作为检测抗体，mAb 10E1(HyTest Oy，Finland)作为捕获抗体；PAPP睞标准品和质控品购于PE公司(质控血清：Control1 508 mIU/L，Control2 2 325 mIU/L，Control3为4 952mIU/L)；鼠IgG(晶美公司)。

　　1.1.2　仪器　Wallac1420多标记计数仪(Wallac OY，Finland )；HPLC 硅柱TSK250尺寸排阻柱( BIO睷AD公司)；96白色微孔板( NUNC公司)、亲和素包被板(Innotrac Diagnostics Oy公司)；Amicon可浓缩离心管(Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut瞣ff)

　　1.2　方法

　　1.2.1　BCPDA的制备　参见文献详细步骤［8～10］。

　　1.2.2　生物素簿垡蚁┌藩睟CPDA［(Bio)x睵VA(BCPDA)y］复合物的构建［11］　用0.5 M的碳酸盐(pH 9.1)缓冲液配制浓度为10 mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液 ，将200 μg NHS睱C睱C睟iotin溶于20 μl碳酸盐缓冲液中，取200 μl上述PVA溶液加入20 μl上述NHS睱C—LC睟iotin溶液中，振荡混匀，室温反应1.5 h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5 M碳酸盐缓冲液将混合液稀释到1 ml，将固体BCPDA研磨成粉末状，先在上述1 ml混合液中加入5 mg BCPDA，用力搅拌，直到溶解，重复加3次BCPDA，5 mg/次，共计20 mg BCPDA，在室温放置5 h～6 h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用0.1 M NaHCO3 5 L透析、过夜、重复透析2次，尽可能除去没反应的BCPDA和生物素。

　　1.2.3　HPLC纯化(Bio)x睵VA(BCPDA)y复合物　离心浓缩上述(Bio)x睵VA(BCPDA)y复合物到0.3 ml～0.5 ml(用Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut瞣ff)。流动相0.05 M Tris缓冲液(pH 7.70)，控制HPLC流速0.8 ml/min，在325 nm处监测层析液(325 nm为BCPDA最大吸收峰)，上样后，马上收集，(Bio)x睵VA(BCPDA)y在10管～16管约5 ml左右，取10 μl(Bio)x睵VA(BCPDA)y层析液加入90 μl水滴入亲和素包被板微孔中，温育30 min，洗板，加入用Tris缓冲液配制的10 M～5 M EuCl3 100 μl，反应10 min，洗板、干燥，用Wallac1420检测Eu3 的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合BCPDA的复合物因无法结合Eu3 而没有荧光，计算标记的PVA，大约每分子结合50个～100个BCPDA分子。

　　1.2.4　构建亲和素采物素睵VA睟CPDA ［(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 ］复合物［11］　用0.1M Tris缓冲液(pH 7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60 g/L，同时加入EuCl3，使Eu3 浓度为10-6 mol/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为1 mg/ml，取上述BSA溶液1 ml，加入10 μl亲和素溶液，再加入50 μl的(Bio)x睵VA(BCPDA)y复合物(通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳用量比，步骤略，结果见后)，混匀，55 ℃温育1.5 h，4 ℃保存备用。

　　1.2.5　(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 复合物反应活性　用生物素化的各种浓度(0 ng/50μl，0.5 ng/50μl，5 ng/50μl，50 ng/50μl，100 ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60 g/L BSA和0.1 mol/L Tris缓冲液(pH 7.8)10倍稀释(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 复合物，在板的微孔中加入100 μl稀释后的(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 复合物，室温反应30 min，洗板、干燥，测量荧光强度(cpm)。本实验是验证复合物的反应活性。