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应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光

2014-09-01 01:08 应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂 ［摘要］ 目的：合成(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 复合物，并用于构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用PVA作为载体结合BCPDA睧u3 和生物素睬缀退兀以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立PAPP睞时间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 复合物，构建PAPP睞试剂检测灵敏度为0.7 mIU/L；批内变异系数在3.89%～4.96%之间,批间变异系数在7.35%～9.27%之间。结论：合成的(SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的构建。构建的PAPP睞试剂灵敏度高，具有潜在的临床应用价值。

　　［关键词］ 妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基1，10啡罗啉2，9二羧酸—铕复合物；唐氏综合征

　　Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time瞨esolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP睞utilizing PVA

　　Abstract :Objective To develop a direct solid phase lanthane time瞨esolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP睞 by synthesizing a complex of (SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 . Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin瞫treptavidin and europium chelate of 4,7瞓is(chlorosulfophenyl)1,10瞤henanthroline2,9瞕icarboxylic瞐cid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two瞫ite sandwich time瞨esolved fluoroimmunoassay of PAPP睞 and evaluated assay characteristics of PAPP睞 kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 and a reagent of PAPP睞. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 010000mIU/L.Intra and interassay imprecision (CV) was 3.89%4.96% and 7.35%9.27%.Recovery was 95.8%104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z(Bio)x睵VA(BCPDA)y睧u3 synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPP睞 was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.

　　Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time瞨esolved fluoroimmunoassay; Streptavidin瞓iotin睵olyvinylamine europium chelate of 4,7瞓is(chlorosulfophenyl)1,10瞤henanthroline2,9瞕icarboxylic瞐cid; Down's Syndrome

　　妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP睞)是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPP睞是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000~250 000亚基构成。PAPP睞亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPP睞。PAPP睞亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Lin—notch重复序列，以及5个短一致重复序列［3］。在体内PAPP睞是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)起作用。胰岛素样生长因子I(IGF睮)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过IGF1受体起作用，IGF睮、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPP睞主要用于产前筛查唐氏综合征(Down's Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为PAPP睞可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Freeβ睭CG可以鉴别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPP睞在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPP睞在ACS患者血清含量＜30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPP睞且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内PAPP睞的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociated enhance lanthane time瞨esolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPP睞时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙烯胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素睬缀退(biotin瞫treptavidin system)系统。