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【摘要】 目的优选鼻渊灵颗粒剂的提取工艺。方法以黄芩苷为指标,采用高效液相色谱法测定黄芩苷含量;用正交实验L9(34)优选鼻渊灵颗粒剂的最佳提取工艺。结果黄芩苷在0.177 2 ~1.772 0 μg范围内线性关系良好(r=0.999 4,n=7),平均回收率为99.3 % , RSD =2.26 % (n = 6);优选的提取工艺为:以10倍药材量的水提取3次,1 h/次,醇沉浓度为50%。结论建立的含量测定方法准确、重复性好,优选出的提取工艺稳定、合理、可行。
【关键词】 鼻渊灵颗粒剂 黄芩苷 正交实验 提取工艺 反相高效液相色谱法
鼻渊灵颗粒剂是治疗鼻渊的有效方药,由黄芩、白芷、苍耳子等组成。黄芩苷是黄芩中具有抗菌作用的活性成分, 亦是鼻渊灵颗粒剂中的主要有效成分。为了提高黄芩苷得率,我们用正交实验法对影响黄芩苷提取条件如提取次数、煎煮时间、加水量、醇沉浓度等进行了研究, 探索适合工业化生产、工艺操作简单、得率高的提取工艺。现报道如下。
1 仪器与材料
1.1 仪器日本岛津高效液相色谱系统SPD-10AVD,SPD-10A VP紫外检测器,手动进样器,N2010 色谱工作站;1810-BC石英自动双重纯水蒸馏器(江苏省金坛市白塔石英玻仪厂);TD200/型电子天平(天津天平仪器有限公司);TG328B型分析天平(上海精科仪器厂);KQ-250B型超声波清洗机(上海必能信超声有限公司)。
1.2 材料黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110715-200514);甲醇(色谱纯,天津市康科德科技有限公司);磷酸(分析纯,开封化学试剂总厂);水为自制新鲜双蒸水。 (科教论文网 lw.NsEac.com编辑整理)
黄芩、白芷、鹅不食草、苍耳子、藿香、薄荷等药材均购于石家庄乐仁堂药房,经鉴定符合2005版《中国药典》规定。
2 方法与结果
2.1 正交实验设计[1]根据预实验结果,影响提取工艺的主要因素有:加水量,提取次数,提取时间,醇沉浓度。本实验采用L9(34)正交表安排实验。以黄芩苷含量为指标,对鼻渊灵的提取工艺进行优选。因素水平表见表1。
2.2 样品提取液的制备按正交表的实验安排,依处方比例称取各味药材,加水浸泡30 min,煎煮、合并提取液,静置过夜,滤过,上清液浓缩成流浸膏,放至室温,醇沉,减压抽滤,滤液回收乙醇至无醇味,调整至每毫升药液含原药材1 g,得样品提取液。
表1 因素水平(略)
2.3 含量测定
2.3.1 色谱条件固定相为迪马公司Diamonsil ODSC18反相柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇∶水∶磷酸(53∶47∶0.2,V/V/V);流速1.0 ml/min ;检测波长274 nm;柱温为室温;进样量20 μl,理论塔板数按黄芩苷计不低于2 500。
2.3.2 对照品溶液的制备[2]精密称取60℃真空干燥4 h的黄芩苷对照品4.43 mg,置 50 ml 棕色容量瓶中,加入甲醇,超声处理20 min,放至室温,用甲醇定容,混匀,得0.088 6 mg/ml 对照品溶液。
2.3.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液1.0,2.0,2.5,5.0,7.5 ,8.0 ,10.0 ml置10 ml棕色容量瓶中,加入甲醇,超声处理20 min,放至室温,再用甲醇定容,进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤,测定峰面积。以峰面积(Y)对进样量(X)作图,得回归方程为:Y=32 689 834X-43 715(r=0.999 4,n=7)。结果表明,黄芩苷进样量在 0.177 2 ~1.772 0 μg范围内呈良好线性关系,最低检测限为0.177 2 μg。
2.3.4 精密度实验精密量取对照品溶液7.5 ml,置10 ml棕色容量瓶中,加入甲醇,依法处理。连续进样5次,测定峰面积。以峰面积大小计算RSD=0.166% (n=5),结果表明本测定系统精密度良好。
2.3.5 重复性实验取对照品溶液5份,每份1.0 ml,置10 ml棕色容量瓶中,加入甲醇,依法处理,进样,测定峰面积。以黄芩苷含量计算RSD=0.08%(n=5),重复性良好。
2.3.6 稳定性实验精密吸取同一份供试液,依法于室温下0,1.0,4.0,8.0,12.0,24.0 h进样,测定峰面积,计算RSD=0.63%(n=6)。表明本检测系统条件下,供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.3.7 加样回收率实验平行精密吸取6份已知含量的供试品原液1 ml,置10ml棕色容量瓶中,分别加入黄芩苷标准品溶液(0.088 6 mg/ml )3.0,3.0,3.8,3.8,4.6,4.6 ml,加入甲醇,依法处理,在上述色谱条件下进行检测。测得6个样品的加样回收率分别为96.2%,101.9%,101.5%,98.5%,97.6%,100%,平均加样回收率为99.3%,RSD=2.26%。
2.3.8 样品测定精密吸取1~9号供试液各1.0 ml,依法处理,按“2.3.1”项下色谱条件检测。正交实验结果见表2,方差分析结果见表3。
表2 L9(34)正交实验结果(略)
表3 方差分析(略)
由表2可见,以黄芩苷的提取总量为指标,各因素中影响大小为A>C>B>D,即提取次数>加水量>提取时间>醇沉浓度,最佳提取条件为A1B2C3D2,即提取3次,每次提取60 min,加水量为10倍,醇沉浓度为50%。方差分析表明,提取次数和加水量为显著因素(P<0.05)。
2.4 验证实验依处方比例称取药材3份,按优选出的提取工艺,照“2.2”项下平行制备样品提取液,在上述色谱条件下测定黄芩苷的含量,每个样品进样两次,求平均值。测得3批样品的浓度分别为0.053 215,0.056 524,0.052 684 mg/ml,平均浓度为0.054 141 mg/ml,均高于正交实验各样品浓度,说明本最佳提取工艺合理。
3 讨论
【参考文献】
[1] 黄祖良,刘胜娟.用正交试验法优选黄芩苷浸提工艺[J]. 广西中医学院学报,2001,4(2):74.
[2] 李冬春,陈黄保.HPLC法测定银黄片中黄芩苷的含量[J]. 中药材,2005, 28(5) :431.