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种新型的基因开关RU486诱导调控系统

2015-03-29 02:05 毕业

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种新型的基因开关—RU486诱导调控系统
小星 尤圣武 彭章龙 于布为
上海交通大学医学院附属瑞金医院麻醉科
随着基因治疗研究的不断深入,目的基因的精确表达已经成为首要问题.由
于解决上述问题最好的方法就是拥有1系列复杂严密的基因调控系统,所以研究
者们1直在寻求1种高效可靠的诱导调控体系,而RU486诱导调控系统就是目
前找到的较好的1种.近10年来这1系统的研究已很广泛,它的结构也有几次大
的改进,现就此予以综述.
RU486调控系统的结构
1 RU486调控系统的基本结构
RU486调控系统是1994年被Wang等[1]提出的,它由嵌合调控子反式作用
调控区和目的基因区两部分组成.反式作用调控区含有任意启动子控制下的嵌合
调控子(chimeric regulator, GLVP),后者是1种嵌合型的可诱导转录因子,它包
括酵母转录因子Gal4的DNA结合区(Gal4DBD),单纯疱疹病毒蛋白VP16激
活区(VP16AD)和PR-891突变体改良后的C末端配体结合区(PRLBD-891)
3部分.目的基因区是指在最小启动子(TATA盒或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动
子tk)和4个Gal4 DNA结合区串联体(p17×4)调控下的目的基因,如图1.
图1 RU486调控系统的结构示意图
在GLVP中,Gal4DBD 代替了孕酮受体的DNA结合区,从而避免了任何
激活内源性孕酮敏感性基因的可能,并且由于GAL4 DBD在哺乳动物细胞中不
中华麻醉在线 http://www.csaol.cn 2007年9月
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存在,目前也没有发现任何哺乳动物的靶基因可以被Gal4激活,所以这1调控
子只会调控目的基因的表达,而不会影响任何内源基因[1].PR-891是指野生型孕
酮受体在891位点平头切断造成的突变体,因此其不能与孕酮受体激活剂R5020
结合,但却可以与抗孕酮片RU486结合,从而在RU486存在时激活孕酮受体介 （科教论文网 lw.nSeAc.com编辑发布）
导的基因.这可能是由于PR-891比野生型受体少42个氨基酸,而孕酮结合位点
属于缺失的下游内,RU486结合区则位于上游位置[2].这就避免了给予RU486
时,激活内源性孕酮受体诱导其它基因引起1系列的细胞反应.并且由于反式作
用调控子是1种嵌合型的可诱导转录因子,所以它不再与孕酮反应元件(PREs)
或糖皮质类固醇应答成分(GREs)结合[3],干预孕酮受体介导的转录,取而代
之的是在RU486作用下,这1调控子仅仅与目的基因区的Gal4DBD结合,并激
活目的基因转录表达[2].由于PRLBD-891的转活能力较差,而VP16AD,即VP16
的 C末端为酸性,可以直接与转录起始复合物中的转录因子TFIIB,TATA结合
蛋白(TBP)和TBP辅助因子TAFII40相互作用,具有很强的转活功能.
在目的基因区内,启动子有两种:胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子(tk)和腺
病毒E1b基因中仅仅包含TATA盒的最小启动子.Tsai[2]等使用氯霉素乙酰转移
酶(CAT)作报告基因对2者进行比较发现,p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT
转染时CAT基础活力明显要低1些;而给予RU486后,前者的CAT效能可达
大约50倍,后者仅有10~15倍.这可能是由于tk启动子中含有GC和CAAT盒
等序列,从而使转录效能较大.所以TATA盒启动子结构应用于要求目的基因的
基础表达很低时,而在基础活力稍高能够耐受,要求转录效能很大时应使用tk
启动子结构.对于p17x4,Gal4 DNA结合区的4个串联体则在这1系统中可以
提供最大的转录效能.
2 RU486调控系统的结构改进
为了使RU486调控系统将来能够应用于人类的基因治疗,降低细胞毒性和
免疫原性,Mark等[4]1999年使用NFκB家族成员――人的p65激活区(286~550)
替代VP16激活区,构建出新的RU486反式作用调控区(GLP65),以减少VP16
激活区可能带来的免疫反应.他们发现使用TATA盒启动子启动目的基因时,在
没有RU486的情况下,GLP65的基础活力明显低于GLVP;给予RU486后两个

调控子均表现出配体剂量依赖性的目的基因表达,这时GLVP组目的基因的表达
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更多,不过由于GLP65的基础值很低,所以RU486给予时,目的基因的表达倍
数会更高.tk做目的基因启动子时,上述两种RU486系统则不管是否给予配体,
两者的作用相当.所以在使用GLP65时,最好选用TATA盒启动子作为目的基
因的启动子.
另外,Mark等[4]在反式调控区与目的基因区之间插入小鸡β-球蛋白5'端区
域作为绝缘子(INS)将2者分隔,使目的基因在没有RU486的情况下不受调控
系统的调节而产生表达.但是他们发现在活体大鼠模型,没有RU486表达,有
无绝缘子都不会有目的基因的表达;但是HELA细胞水平上,不含绝缘子者的
目的基因则会有较少的表达,而含绝缘子者没有.
2 RU486调控系统的激活
RU486调控系统的激活过程与甾体类激素被其配体激活相似.反式作用调
控子可以在不同的组织定向启动子作用下,在各自靶向的组织或细胞进行表达.
当存在RU486时, RU486与PRLBD-891相结合,促使反式作用调控子发生构
象变化形成2聚体而激活,激活的反式作用调控子与目的基因上游的Gal4 DNA
结合区4聚体结合,从而启动目的基因的表达,如图2.反之,在没有RU486
的情况下,由于反式作用调控子的构象不会发生变化,所以RU486调控系统不
能被激活,即目的基因不能转录表达.这样,RU486调控系统便可根据RU486
的量及给予时间,对目的基因的表达水平及其表达时程的长短进行控制[2].
图2 RU486调控系统激活示意图
3 RU486调控系统的特点
1. 调控子的激活依赖于RU486的给予.在没有RU486的情况下,调控子所表
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达的蛋白没有毒性,也不传递表型,调控子不能激活目的基因的表达.只有
给予RU486激活调控子后,目的基因才会表达蛋白.
2. RU486调控系统在转录水平调控目的基因的表达,所以可以直接控制后者的

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表达.
3. RU486给予量很小,仅仅能够激活调控子,并不能抑制内源性孕酮受体或糖
皮质激素受体的功能.众所周知,RU486作为孕酮和糖皮质激素的拮抗剂时,
它的浓度范围须达微克分子级,所以在临床使用中RU486作为流产药物的
剂量应达600mg或10mg/kg.然而,在RU486调控系统中的RU486只需很
少的浓度就可使目的基因表达.Wang等曾做RU486的浓度对照实验发现,
当RU486浓度仅有0.1nmol/l时即可诱导目的基因的表达,并且系统达到最
大活力时的浓度也仅须1nmol/l,这1剂量要比产生内源拮抗作用的浓度低
1000倍[1].
4. 调控过程是可逆的,且其使目的基因大量表达.RU486停药后目的基因表达
停止,RU486的重复给予也会重复诱导目的基因的表达.
5. RU486调控系统非常适用于中枢神经系统的基因治疗.因为服用RU486后,
其很容易通过血脑屏障,在临床中可以安全使用.
4 RU486调控系统的应用
1 RU486调控系统在单纯疱疹病毒载体(HSV)中的调控
Oligino[5]等将RU486系统引入无复制能力HSV载体中,lacZ为目的基因的
目的基因区(p17x5-TATA-lacZ)插入HSV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶位点,反式
作用调控区(VP-GL)置入同1载体的糖蛋白C位点,构建成HSV重组病毒
GVHLZ.在病毒转染Vero细胞24h后,他们发现如果不给RU486,lacZ表达很
低;若将细胞培养在含10-7mol/L的RU486基质中时,lacZ就会大量表达.并且,
10-7mol/L的RU486即可使目的基因表达达最大.将GVHLZ注入SD大鼠海马
后12和36h,给予RU486或生理盐水作对照,48h后处死大鼠取出海马进行检
测,Oligino发现lacZ表达比对照组高达150倍.
2 RU486调控系统在腺病毒载体(Ad)中的调控
Magnus等[6]首次将RU486系统引入重组腺病毒载体中,CAT作为报告基因
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与p17x5-TATA结合插入Ad中形成AdG5TripCAT,反式作用调控区插入Ad形
成Ad5dl309,将两者共转染HeLa细胞.他们在转染开始给予RU486后16h用
ELISA法检测CAT的表达,发现CAT的表达随RU486给予量增加而逐渐增大,
当RU486达4umol/l时CAT达最大.
2004年,钱程[7]等成功构建出RU486调控并携带IL12的第3代腺病毒,并
将其进行了体外及体内的实验验证,发现RU486可以诱导和调控IL12的表达,
这种诱导呈剂量依赖性变化,并且在调整RU486的给药间隔和重复给药,IL12
的表达也会随其波动变化或维持在1定水平,RU486调控系统的基因开关作用
表现完全.最近,Schillinger[8]等也将RU486诱导调控系统引入到高血压的基因
治疗,将RU486调控系统控制的心房利尿肽(ANP)插入到第3代腺病毒载体
中,从而实现了对ANP表达的剂量和时程控制.并且第3代腺病毒的超大容量,
低免疫源性和低细胞毒性等优点使得这1系统更加完美.
3 RU486调控系统在果蝇中的调控
Gregg Roman[9]等利用RU486调控系统对转入果蝇的目的基因进行时间和空
间的调控.他们将RU486调控系统插入到P{Switch}放大检测元件构成的质粒注
入果蝇胚胎中,待果蝇4天大时给予RU486饮食.结果发现通过RU486基因开
关可以对目的基因进行时序上的调控,在给予RU486饮食后1h即可得到非常高
浓度的表达,3h后指示针可以检测到目的基因的活力.并且RU486的给予不会
引起任何的不良反应,它不会增加果蝇的致死率,也不会影响果蝇的趋光性,趋
地性和逃避反应等行为,仅有基因开关的诱导功能.Osterwalder[10]等则利用
RU486调控系统对组织特异性的基因表达进行调控,发现在果蝇胚后期,RU486
调控系统可以调控幼虫神经肌肉接头突触前后的转基因表达.
4 RU486调控系统在转基因动物中的调控
2005年Bo等[11]又将RU486诱导调控系统转入到转基因大鼠体内,通过控
制RU486的给予观察转基因大鼠心内转基因的表达.他们使用心脏特异性α肌
球蛋白重链(αMHC)启动子调控GLP65系统,将含有反式作用调控区的载体

（转载自中国科教评价网www.nseac.com ）

注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65转基因大鼠,然后同样方法得到
含人生长激素目的基因区(17X4-tk-hGH)的转基因大鼠,两者杂交得到双重转
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基因大鼠(αMHC-GLP65/Hgh),然后每天给大鼠腹腔内注射RU486(500ug/kg)
观察.结果发现不给予RU486,hGH的表达始终处于很低的基础值;而随着RU486
的不断给予转基因大鼠的hGH呈剂量依赖性表达,但在停药后7天内转基因表
达即可降至基础水平;对于单转基因αMHC-GLP65大鼠,给予RU486后未发现
任何表型出现.并且他们还首次报道,这1调控系统的作用对于任何年龄的大鼠
都可适用.
5 其他的基因开关
目前基因开关的种类已经有很多,如4环素调控系统,甾体激素,免疫抑制
剂,β-D-异丙基硫代半乳糖苷,FK1012细胞膜调控系统等等.虽然这些调控系
统各自有各自的应用范围和优点,但是其中有些可能会激活其它的内源基因,如
FK1012细胞膜调控系统,它是运用1种免疫抑制剂FK506的2聚体FK1012,
通过激活细胞酪氨酸激酶途径来调控基因表达,因此由于细胞膜受体激酶级联反
应干预多种内源基因的表达,所以这1系统无法调控特异的目的基因[2].有些效
力较低,或者在动物和人转基因运用中毒性较大(β-D-异丙基硫代半乳糖苷).
4环素调控系统则由于4环素在骨与其他组织的清除率较慢而引起关注.