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IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞生物学特

2015-04-07 01:17 毕业

【摘要】目的 观察IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性细胞因子分泌的影响。方法 在已经建立的转染pcDNA3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs的基础上，用MTT法绘制两细胞株的生长曲线，用流式细胞仪检测其增殖指数，以5％小牛血清诱导分化后，采用western blot检测两株细胞的分化情况，同时用realtime RT-PCR比较TNF-α、IL-1β和IL-6在两种细胞株中的表达。 结果 生长曲线及流式细胞仪测得的细胞增殖指数提示：转染pcDNA3.1/IκBαM INPCs的增殖速度较转染pcDNA3.1的INPCs明显降低。经血清诱导分化后，两者均大量表达胶原纤维酸性蛋白；转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs较转pcDNA3.1的INPCs IL-1β和IL-6的表达减低，但TNF-α表达变化无显著性。结论 IκBα突变型基因可减慢INPCs的增殖，并减少部分炎性细胞因子的表达，但对INPCs的分化无显著影响。
【关键词】干细胞； NF-κB抑制因子α；细胞增殖；细胞分化；细胞因子

Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain
ZHU Chang, LIU Zhi-heng, ZHANG Chuan-han, et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, China

【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs, MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs, reduce the expression of some cytokines, but didn’t influence the differentiation of INPCs. 内容来自www.nseac.com
【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines
本实验室成功构建了SV40Tag永生化的大鼠神经前体细胞株（INPCs）[1]，并在此基础上构建了转IκBα突变型基因永生化神经前体细胞株。作为细胞移植治疗的细胞来源和外源基因的载体，INPCs的生物学特性在转入外源基因后有何改变，是进1步研究首先应关注的问题。本研究拟通过比较转IκBα突变型基因及空白对照载体的INPCs在增殖、分化以及细胞因子分泌功能上的差异，为进1步将该转基因细胞用于细胞移植治疗脑缺血等中枢神经系统疾病奠定基础。
材料与方法
材料 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本实验室构建，DMEM/F12培养基、B27无血清培养添加剂（Gibco公司，美国）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)（Pepro Tech公司，英国）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美国）；抗β-actin抗体、抗胶原纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、抗微管相关蛋白2（MAP2）抗体（Neomarkers公司，美国）； Trizol试剂（上海华舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。
细胞培养及传代 转染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培养基中，置37℃、5%CO2培养箱培养，0.25％胰酶消化传代。
细胞生长曲线的绘制 将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接种于96孔板，共种8板，每板每株细胞接种12孔，每24h取出1板，每孔加入0.2％MTT 50μl，继续培养4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震荡10 min，在酶标仪（Bio-Rad公司，美国）上测定570nm吸光度值，并绘制生长曲线。
细胞增殖指数的测定 将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分别制成单细胞悬液，PBS 洗1次后，加入-20 ℃预冷的80 %乙醇固定, 冰浴30min，固定后的细胞用PBS 洗涤2 次，调整细胞浓度为1 ×106 / ml，加入PI (终浓度为50μg/mL)和RNA酶（终浓度为1μg/ml）， 室温避光孵育1h后上机检测，细胞增殖指数= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。

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Western blot检测细胞分化 分别提取转pcDNA3.1 INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的细胞总蛋白，两株细胞以5％血清诱导分化1周后分别提取总蛋白，以β-actin为内参照，取等量的蛋白质经10%聚丙稀酰胺凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜上, 用5%脱脂奶粉封闭1h，加10μg/ml抗GFAP单抗、抗MAP2单抗或抗β-actin单抗，室温孵育1h，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的2抗，室温孵育1h，漂洗后2氨基联苯胺显色2～3 min，水洗后照相。
Realtime RT-PCR 检测细胞因子的表达 用Trizol试剂提取转pcDNA3.1 INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的总mRNA，8453E型紫外分光光度仪（Agilent公司，美国）测定RNA浓度，参照SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒说明操作，用等量的总mRNA进行逆转录，然后以逆转录产物为模板在LightCycler real-time PCR仪（罗氏公司，美国）上进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性10 s，94℃变性5 s，60℃退火及延伸20s，共反应40个循环后，分析融解曲线，参照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析细胞因子的的相对表达量[2]，引物列表见表1。
统计学处理　采用SPSS 12. 0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，不同细胞株间比较采用成组t检验，P < 0. 05为差异有统计学意义。
结 果
生长曲线的绘制 采用MTT法绘制的转pcDNA3.1INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生长曲线，见图1。除接种后第1天外，各时点转pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均较相同时点转pcDNA3.1 INPCs低，同时点两株细胞间比较，差异有统计学意义。
流式细胞仪检测细胞增殖指数 转pcDNA3.1INPCs 及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的细胞增殖指数依次为61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，两者比较，差异有统计学意义。
Western blot检测细胞分化 血清诱导分化后，两株细胞MAP2的蛋白条带极其微弱，GFAP条带明显，诱导分化前，转pcDNA3.1INPCs 及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明显的MAP2条带，而无明显的GFAP条带，两株细胞间比较，MAP2和GFAP条带的明暗程度在分化前及分化后无明显差异。（见图2） （科教作文网http://zw.nseAc.com）
细胞因子的表达 用Realtime RT-PCR的方法检测转pcDNA3.1 INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs细胞因子mRNA的相对表达量，如表2所示。将转pcDNA3.1INPCs相应细胞因子的表达量定义为1，两株细胞TNF-α的mRNA表达差异无统计学意义，转pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表达较转pcDNA3.1的INPCs低，差异有统计学意义。
讨 论
神经前体细胞具有不断分裂增殖、自我更新以及多分化潜能[3]。转pcDNA3.1INPCs 及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培养和传代证实，转入IκBα突变型基因后，INPCs仍能不断分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通过半定量的方式证实，转入的外源基因并未影响INPCs的分化特性，即血清诱导分化后大部分细胞表达作为星形胶质细胞标志的GFAP，分化为星形胶质细胞，仅有少量细胞表达作为神经元标志的MAP2，分化为神经元。增殖和分化潜能的保持即证实了转pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神经前体细胞的特性，同时也是该细胞株用于细胞移植治疗的基本保证。
NF-κB是广泛存在于真核细胞内的核转录因子，在免疫反应、炎症、细胞生长、分化、凋亡和癌症的发生等方面发挥多种重要的生理学功能。国内王剑虹等人的研究证实，IκBα突变型基因转入肝癌细胞后，可以抑制NF-κB的活性，同时抑制癌细胞的增殖[4]。Widera等人的研究也证实，TNF可通过激活NF-κB促进神经干细胞的增殖，其原理可能与NF-κB激活后，细胞周期蛋白D1上调有关[5]。本实验也观察到，转入IκBα突变型基因后，INPCs生长减慢，细胞增殖指数降低，推测该现象是由于IκBα突变型基因下调NF-κB的活性，使NF-κB下游的1些促细胞增殖的基因也相应下调，减弱了细胞增殖。
1些研究证实，微环境是影响干细胞移植治疗效果的重要因素[6] ，细胞因子是微环境的重要成分。INPCs作为细胞移植治疗的种子细胞，即受到移植处微环境的影响，同时也通过分泌TNF-α、IL-6 、IL-1β等细胞因子影响微环境。TNF-α、IL-6 、IL-1β等细胞因子是受NF-κB调控的炎性细胞因子，实验证实，在脑缺血的病理生理过程中，这些细胞因子的表达增多[7]，且增高的程度与缺血缺氧性脑病的临床预后有关[8]。IL-6 、IL-1β作为炎性细胞因子，参与缺血后炎性细胞的浸润，TNF-α影响神经前体细胞的增殖[5]。IκBα突变型基因减少INPCs中IL-6 、IL-1β mRNA的表达，使转pcDNA3.1/IκBαM INPCs合成及分泌的炎性细胞因子减少，对微环境的影响减小，同时也使该细胞株对周边环境中引起NF-κB上调的因素不敏感，从而有望改变细胞株移植后的命运。 （科教作文网http://zw.ΝsΕac.cOM编辑）
本实验证实，转IκBα突变型基因的INPCs细胞增殖减慢，部分炎性细胞因子的表达减少，但细胞不断增殖和多向分化的特性不受影响，神经前体细胞基本特性的保持是转pcDNA3.1/IκBαM INPCs更进1步应用于细胞移植治疗的基本保证，同时转pcDNA3.1/IκBαM INPCs对周边环境的不敏感性有望改善细胞移植的效果。
参考文献
1 高峰，田玉科，杨辉，等. 猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建. 中华麻醉学杂志, 2005,25:597-600.
2 Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－σσCT method. Methods, 2001,25:402-408.
3 Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cell: an overview. Cire Res,2003,92:598-608.
4 王剑虹，黄庆科，陈民新. 变异IκBα抑制肝癌细胞株SMMC-7721中NF-κB活性及细胞生长.中华肝脏病杂志，2003，4：222-224.
5 Widera D，Mikenberg I，Elvers M，et al. Tumor necrosis factor alpha triggers proliferation of adult neural stem cells via IKK/NF-kappaB signaling. BMC Neurosci，2006，7：64.
6 Monje ML，Mizumatsu S，Fike JR，et al. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med, 2002,8(9):955-962.
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8 Aly H，Khashaba MT，El-Ayouty M，et al. IL-1beta, IL-6 and TNF-alpha and outcomes of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy. Brain Dev, 2006,28(3):178-82.