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IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体

2015-04-07 01:17 毕业

【摘要】 目的 检测在缺氧缺糖环境中，IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株（INPCs）NF-κB的活性、细胞存活及细胞损伤的影响。方法 在建立转染pcDNA3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM INPCs的基础上，用MTT法检测缺氧缺糖处理3h、6h、9h后两细胞株的存活率，用荧光素酶报告基因检测两细胞株缺氧缺糖6h前后NF-κB的活性，并测定缺氧缺糖6h处理后培养液中乳酸脱氢酶的含量，用Hoechst33342染色观察细胞核的形态。 结果 转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs 中NF-κB的活性均低于转pcDNA3.1的INPCs，缺氧缺糖6h或9h时，前者存活率高于后者，且6h时前者上清中的乳酸脱氢酶释放量较少，缺氧缺糖可使两细胞株部分细胞的核均呈现调亡改变。 结论 IκBα突变型基因可降低INPCs中NF-κB的活性，提高INPCs在缺氧缺糖处理后的存活率，减轻细胞损伤。
【关键词】干细胞； NF-κB抑制因子α； 细胞缺氧

基金项目：国家自然科学基金资助项目（30300328）
作者单位：1华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 湖北 武汉 430030；2 深圳市第2人民医院麻醉科 广东 深圳 518035］
通信作者：张传汉 02762998989 email：chzhang@tjh.tjmu.edu.cn
第1作者联系电话：13627131570 email：zhchag@yahoo.com.cn
Mutated IκBα gene reduce the cell damage of immortalized neural progenitor cell induced
by oxygen-glucose deprivation
ZHU Chang, LIU Zhi-heng, ZHANG Chuan-han, et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, China
【Abstract】 Objective To establish the effect of mutated IκBα gene on immortalized neural progenitor cell strains (INPCs) in oxygen-glucose deprivation. Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs, the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 3h, 6h or 9h, MTT staining was used to detect the survival rate of the two cell strains. Luciferase assay system was used to detect the activity of NF-κB in pcDNA3.1 transfected or pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs. Lactate dehydrogenase in culture medium was measured after the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6h. The morphological change of two cell strains was observed by Hoechst 33342 staining. Results The activity of NF-κB was down-regulated in pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs before or after oxygen-glucose deprivation. The cell survival rate of pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs was higher than pcDNA3.1 transfected INPCs after the cells was exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6h or 9h.But there was no difference in cell survival rate at 3h. After the cells were exposed to anoxic/hypoglycemic condition for 6h, Lactate dehydrogenase content in culture medium was lower in pcDNA3.1/IκBαM transfected INPCs. Observed by Hoechst 33342 staining, cells were apoptosis after oxygen-glucose deprivation. Conclusion By down-regulated the activity of NF-κB mutated IκBα gene improves the cell survival rate of INPCs and lessens the cell damage caused by oxygen-glucose deprivation.

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【Key words】Stem cells； NF-kappaB inhibitor alpha；Cell hypoxia

本实验室成功构建了转IκBα突变型基因永生化大鼠神经前体细胞株（immortalized neural progenitor cell strain, INPCs）[1]，并证实该细胞株中IκBα突变型基因可下调NF-κB的活性，使部分炎性细胞因子的表达减少。由于NF-κB的作用广泛复杂，其活性的变化在不同细胞及不同刺激情况下所引发的效应不同[2]，下调NF-κB的活性在INPCs中所引发的效应目前尚不清楚。本实验拟检测在正常及缺氧缺糖培养条件下，转IκBα突变型基因及对照载体的INPCs 细胞存活及受损的情况，判断IκBα突变型基因下调NF-κB的活性后，INPCs对缺氧缺糖耐受性的变化，为进1步探讨其可能机制以及将该细胞用于移植治疗脑缺血等中枢神经系统疾病奠定基础。
材料和方法
材料 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本实验室构建，NF-κB荧光素酶报告质粒6×κB（德国Heike L Pahl教授惠赠）。DMEM/F12培养基、B27无血清培养添加剂、脂质体lipofectamineTM2000（Gibco公司，美国）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)（Pepro Tech公司，英国）； MTT、hoechst33342（Sigma公司，美国）；荧光素酶检测试剂盒（Promega公司，美国）。
MTT法检测细胞存活率 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs置无血清培养基培养，培养基成分为：DMEM/F12培养基添加bFGF、EGF各20ng/ml，1×B27，青、链霉素各100U/ml，以5×105/ml的密度接种于96孔板，每孔0.1ml，每株细胞每板接种24孔，共种4板，置37℃、5%CO2培养箱培养24h后，留1板作为对照组，其余3板作为实验组，将实验组培养液换为无糖Earle’s 液后，利用3气水套式培养箱，充以氮气，使氧气浓度维持在3％，2氧化碳浓度为5%，分别处理3h、6h及9h，然后将4板的培养液均换为DMEM/F12培养基，加入0.2％MTT 50μl/孔，继续培养4h（37℃、5%CO2），吸去上清液，加入150μl/孔DMSO，震荡混匀，在酶标仪（Bio-Rad公司，美国）上测定570nm吸光度值(A570)。以对照组的细胞存活率为100%, 以细胞存活率＝实验组A570值/对照组A570值×100%计算细胞存活率。 （科教范文网http://fw.nseac.com）
NF-κB活性的检测 用脂质体转染法将含有荧光素酶报告基因的质粒6×κB分别转入稳定转染pcDNA3.1的INPCs及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs中，48后，1批细胞置原培养环境，另1批细胞按上述缺氧缺糖条件处理6h，根据Promega公司荧光素酶检测试剂盒说明操作，以荧光强度来表示NF-κB活性。
乳酸脱氢酶的检测 分别将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以1×106/孔的密度接种于6孔板，共种2板，接种24h后，1板按上述缺氧缺糖条件处理6h，另1板将培养液换为DMEM/F12培养基，置正常培养环境培养6h，分别取上清，离心除去沉淀后，用全自动生化仪测定上清中乳酸脱氢酶的含量。
细胞核形态的观察 将经缺氧缺糖处理6h和正常培养状态下的转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs用甲醇固定15min，加入终浓度5μg/ml的Hoechst33342避光反应10min，荧光显微镜观察细胞核形态。
统计学处理　采用SPSS 12. 0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，不同细胞间比较采用成组t检验，P < 0. 05为差异有统计学意义。
结 果
细胞存活率的检测 各处理时点转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs存活率见表1，缺氧缺糖3h，两细胞株存活率差异无统计学意义，缺氧缺糖6h、9h时，转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs存活率高于转pcDNA3.1的INPCs，差异有统计学意义。
NF-κB活性的检测 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs常规培养，NF-κB活性分别为：7828±231、1924±185；缺氧缺糖处理6h后，NF-κB活性分别为：1101±50，744±27，差异均有统计学意义。
乳酸脱氢酶检测 等细胞密度的转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs，缺氧缺糖处理6h后，上清中的乳酸脱氢酶分别为391±33 u/L和247±14 u/L，差异有统计学意义。
细胞核形态的观察 荧光显微镜下观察细胞核形态的变化，转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs处理前，细胞核形态正常，缺氧缺糖处理6h后，有部分细胞出现染色质浓缩、边缘化等调亡特征性改变（见图1），但两组细胞呈调亡改变的细胞计数差异无统计学意义。 （转载自科教范文网http://fw.nseac.com）
讨 论
神经前体细胞具有不断分裂增殖、自我更新以及多分化潜能[3]，可作为中枢神经系统修复的细胞来源和外源基因导入的载体，在治疗脑缺血等中枢神经系统疾病中有着广泛的应用前景。但目前，直接的神经前体细胞移植治疗存在细胞存活有限，以及与宿主细胞的功能整合不佳等问题[4]，因此必须着手改善神经前体细胞在移植环境中的存活及功能。
NF-κB是广泛存在于真核细胞内的核转录因子，在免疫反应、炎症、细胞生长、分化和凋亡等方面发挥多种重要的生理学功能[5]。目前，干预NF-κB的活性在中枢神经系统缺血缺氧中所引发的效应研究中，有众多不同的研究结果。Duckworth EA等人发现p50基因敲除鼠的大脑中动脉缺血模型中，NF-κB的激活减少，神经元的死亡明显较非基因敲除组增多，认为大脑中动脉缺血时，NF-κB的激活对神经元起保护作用[6]。而Jatana M等人的研究发现，大脑局部缺血时，用5－脂氧化酶抑制剂抑制NF-κB的激活可起到神经保护作用[7]。Zhang W等人以特异性启动子启动的IκBα突变型基因为工具，发现大脑中动脉缺血时，抑制NF-κB在神经元的激活可减少梗塞面积和神经元的调亡，而抑制胶质细胞中NF-κB的激活无明显作用[8]。这些研究表明，干预NF-κB活性所产生的效应有很强的特异性。
本实验通过IκBα突变型基因下调INPCs中NF-κB的活性，提高了转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs缺氧缺糖处理6h及9h后的存活率。缺氧缺糖3h、6h及9h，转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs细胞存活率变化不大，可见该细胞对缺氧缺糖耐受性较好。同时缺氧缺糖6h后，转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs释放的乳酸脱氢酶也较少，细胞受损程度较轻。关于降低NF-κB的活性减少细胞调亡的机制，多数研究认为与抑制NF-κB的活性降低了炎性因子的表达有关，而在INPCs中的具体机制目前尚需进1步研究。两细胞株缺氧缺糖前后进行Hoechst33342染色，调亡细胞计数差异无统计学意义，这可能与固定过程中部分调亡的细胞脱落以及该方法的敏感性不高有关。 大学排名
本实验使用含有荧光素酶报告基因的质粒6×κB检测NF-κB的活性，该质粒转入细胞后，细胞内激活的NF-κB能特异性启动荧光素酶的表达，荧光素酶的表达量反映了NF-κB的活性[9]，而荧光素酶的表达量可以通过其催化相同量的底物所发出的荧光强度来反映。在正常培养状况及缺氧缺糖处理6h后，转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs中NF-κB活性均低于转pcDNA3.1的INPCs。在缺氧缺糖后，理论上应观察到NF-κB活性的增高，但实际所测得的荧光强度低于对照组，其原因可能是：细胞的数量和活性对荧光素酶的合成有直接影响，在缺氧缺糖处理后，虽然有活性的NF-κB增多，可启动荧光素酶的转录，但能量供应障碍使荧光素酶的转录和翻译受到抑制，使最终荧光素酶的合成总量减少，所测得的荧光强度降低。1些实验者通过共转染以CMV为启动子的β-半乳糖苷酶质粒，以荧光素酶催化底物所发出的荧光强度和β-半乳糖苷酶催化底物所得产物的光密度值之比来反映不同样本间NF-κB相对转录活性，该方法可校正不同样本间细胞数目及存活状态，使实验更加严谨。
本实验体外模拟缺氧缺糖环境，检测了转IκBα突变型基因及对照载体的INPCs中NF-κB的活性、细胞存活及受损情况，证实转IκBα突变型基因通过降低INPCs中NF-κB的活性，提高了INPCs在缺血缺氧处理后的存活率，减轻了细胞损伤。转pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在缺血缺氧环境中有较高的存活率，是进1步用于移植治疗脑缺血等中枢神经系统疾病的良好细胞来源，而存活率提高的机制和及细胞移植治疗的具体疗效尚需进1步研究。
参 考 文 献
1 高峰，田玉科，杨辉，等. 猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建[J]. 中华麻醉学杂志, 2005,25:597-600.
2 Hoffmann A, Levchenko A, Scott ML, et al. The IkappaB-NF-kappaB signaling module: temporal control and selective gene activation[J]. Science, 2002, 298:1241-1245. （科教论文网 lw.nSeAc.com编辑发布）
3 Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cell: an overview[J]. Cire Res,2003,92:598-608.
4 Arvidsson A,Collin T,Kirik D, et al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke[J]. Nat Med, 2002, 8(9):963-930.
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6 Duckworth EA,Butler T,Collier L, et al. NF-kappaB protects neurons from ischemic injury after middle cerebral artery occlusion in mice[J]. Brain Res, 2006, 1088(1):167-175
7 Jatana M, Giri S, Ansari MA, et al. Inhibition of NF-kappaB activation by 5-lipoxygenase inhibitors protects brain against injury in a rat model of focal cerebral ischemia[J]. J Neuroinflammation, 2006, 11;3:12.
8 Zhang W, Potrovita I, Tarabin V, et al. Neuronal activation of NF-kappaB contributes to cell death in cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2005, 25(1):30-40.
9 Pahl HL, Baeuerle PA. Expression of influenza virus hemagglutinin activates transcription factor NF-kappa B[J]. J Virol, 1995, 69:1480-1484.

表1 缺氧缺糖处理后转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs存活率

缺氧缺糖3h

缺氧缺糖6h

[1]