NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的
2015-04-05 01:14
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【摘要】 研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶
【摘要】 研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA)还原酶抑制剂匹伐他汀(pitavastatin, NK-104)对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响。方法:采用细胞培养技术,以肝癌细胞系HepG 2为靶细胞,以不同浓度的药物处理细胞48 h后,利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测caspase-3活性。结果:NK-104(10 μmol/L)对HepG 2细胞有明显抑制作用,可诱导HepG 2细胞凋亡,并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG 2细胞凋亡,其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。
【关键词】 肝癌
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA, HMG-CoA)还原酶抑制剂,统称为抑制素,是重要的脂类合成抑制剂,主要在人体肝脏中代谢,临床上广泛应用于治疗高脂血症[1]。 最近研究发现,HMG-CoA还原酶抑制剂具有
生物学多效性,与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用[2]、体内与5氟尿嘧啶(fluorouracil, 5-Fu)共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期[3]。匹伐他汀(pitavastatin, NK-104)是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂[4]。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K-Akt)基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道[5],但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG 2通过2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二硫代苯)-2H-四氮唑单钠盐 {[2-(2-methoxy-4-nitrophe-nyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt], WST-8}、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法,研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响,为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。
您可以访问中国科教评价网(www.NsEac.com)查看更多相关的文章。 1 材料和方法
1.1 主要材料与仪器 NK-104,日本兴和有限公司(日本名古屋)和日产
化学工业公司(日本东京)产品;荧光染料Hoechst 33258、甲羟戊酸( mevalonic acid, MEV)和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液(PI 100 g/L, 1% Triton 100, 9 g/L NaCl),Sigma公司产品。流式细胞仪,2000 FCA,美国BD公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG 2(美国ATCC公司产品)在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5% CO2、37 ℃条件下培养。实验中,细胞种植于适当培养皿中,90%的细胞融合时,用磷酸盐缓冲液洗净后,加入适量含有NK-104和MEV( 1 mmol/L )等药物的培养液,37 ℃培养箱中培养。
1.2.2 WST-8方法 利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG 2细胞(1×104个细胞/孔)接种于含100 μl培养液的96孔培养板中,NK-104( 0.1 ~100 μmol/L)治疗48 h后,分别加入WST-8试剂10 μl(日本同仁化学研究所)培养2 h后,选择450 nm波长,测定各孔的吸光度OD值。
1.2.3 Hoechst 33258染色 细胞经药物刺激 48 h 后,甲醇-冰乙酸(3∶1)细胞固定液4 ℃固定5 min,磷酸盐缓冲液稍洗后,点加Hoechst 33258染色液, 10 min 。用滤纸沾去多余液体,封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。
1.2.4 流式细胞仪检测凋亡峰 在室温下将刺激48 h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次,并在适当的染色缓冲液中吸取100 μl的细胞(1×105)至试 管中。加入200 μl RNase A,37 ℃水浴30 min,再加800 μl PI染色液混匀,4 ℃避光30 min后,立即上机分析。
1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 经药物治疗 48 h 后收集细胞,采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定(Medical