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1 引 言 卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，化(2)

2013-07-26 01:25
分别提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA 的纯度和浓度，RT-PCR 操作按照RT-PCR试剂盒说明书进行。PCR扩增条件见Table1。同时扩增管家基因β-actin作为对照验证，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。紫外灯下观察并拍照，每个样本重复3 次。

　　3。4 Western blot 法
取指数生长期细胞，加0。5 ml/瓶细胞裂解液，上清液用BCA 法测定蛋白浓度。准确吸取不同转染细胞的样品各50 μg，加载至SDS-PAGE 凝胶上电泳，然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质通过电转移印迹到NC 膜上，80 v 转移50 min。用5%牛血清白蛋白封闭NC 膜1 h，加1: 2000 稀释的抗p38MAPK、p-p38MAPK、caspase-3 抗体，室温3 h，然后用1: 8000 稀释的HRP 标记的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG 二抗室温3 h。ECL 试剂显色：等比例混合ECL 试剂盒中的A 液、B 液，与膜反应1 min，显影，定影，测蛋白条带的灰度值。

　　3。5 流式细胞仪(FCM)
检测细胞凋亡p38MAPK 特异性抑制剂SB203580 处理RMG-I-H 细胞：选取指数生长期RMG-I-H 细胞制成单细胞悬液，以2×105/培养皿接种于35 mm 培养皿中，培养细胞接种至培养皿36 h后弃去10%胎牛血清的培养液，加入含0。1% DMSO 的SB203580 培养液，浓度分别为0。1mM，1 mM，10 mM，另设同样浓度的0。1% DMSO 为对照组，继续培养24 h，收集细胞。

　　按Annexin-V-FICT/PI 试剂盒操作说明染色，利用流式细胞仪进行检测。

　　3。6 统计学处理
采用SPSS13。0 软件进行统计分析。计数资料用t 检验。 P<0。05 视为有统计学意义。

　　4 结果
4。1 p38MAPK、p-p38MAPK 在细胞内的定位分析
4。2 两种细胞系中FUT-1、p38MAPK、
caspase-3 基因的表达利用RT-PCR 法分别检测RMG-I 与RMG-I-H 细胞中FUT-1、p38MAPK、caspase-3 基因的表达情况，结果显示：FUT-1 基因在RMG-I-H 细胞中的相对表达强度明显高于RMG-I(P<0。05) (FIG。 2A)；p38MAPK 基因在RMG-I-H 细胞相对表达强度也明显高于RMG-I(P <0。05)(FIG。2B)；而caspase-3 基因在RMG-I-H 的相对表达强度明显低于RMG-I(P <0。05) (FIG。 2D)。

　　4。3 两种细胞系中p38MAPK、p-p38MAPK、caspase-3 蛋白的表达利用Western blot 法检测RMG-I 与RMG-I-H 细胞p38MAPK、p-p38MAPK 及caspase-3蛋白的表达，结果显示：RMG-I-H 细胞p38MAPK 相对表达强度虽然没有显着差异(P >0。05)，但其磷酸化形式p-p38MAPK 相对表达强度明显高于RMG-I(P <0。05) (FIG。2C)，而caspase-3与基因的变化相一致，RMG-I-H 其相对表达强度明显低于RMG-I(P <0。05) (FIG。2E）。

　　4。4 抗Lewis y 抗体处理后

（转载自http://www.ＮＳＥＡＣ.com中国科教评价网）

38MAPK 表达减少实验分三个组：实验组(加入Lewis y 抗体)、空白组、对照组(加入兔抗人IgG)。利用抗Lewis y 抗体处理转染后细胞RMG-I-H，结果显示，与空白组和对照组比较，处理后细胞p38MAPK 基因的表达强度明显降低(P <0。05)，并随着Lewis y 单克隆抗体作用时间的延长而逐渐降低(P 均<0。05) (FIG。 3A, 4B)，对照组和空白组间差异无显着性(P>0。05)；转染后细胞p38MAPK 相对表达强度虽然没有显着差异，但其磷酸化形式p-p38MAPK 相对表达强度明显下降(P <0。05)，其强度随着抗体作用时间的延长逐渐减少(P 均<0。05) (FIG。 3C, 4D)，对照组和空白组比较差异无显着性(P>0。05)。

　　4。5 SB203580 作用后
RMG-I-H 细胞凋亡率、p38MAPK 和caspase-3 的变化4。5。1 细胞凋亡率增加用Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色(图左下象限)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC 染色，碘化丙啶染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色(图右上象限)。 图左上象限出现的是许可范围内的检测误差。每个样本计数1×104 个细胞，在SB203580 0。1 mM，1 mM 及10 mM 三个不同浓度作用下实验组细胞RMG-I-H 的凋亡率分别为(15。927±0。861) %、(18。187±0。481) %及(33。565±0。912) %，明显高于对照组和空白组(P均<0。05)，随着SB203580 作用浓度增加，细胞的凋亡率增加(P 均<0。05)，而对照组三组间及其和空白组间的凋亡率无明显差别(P 均>0。05) (FIG。4)。