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1 引 言 卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，化

2013-07-26 01:25

　　
1 引 言
卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，化学药物治疗仍是术后治疗的主要手段，虽然以铂类为主的联合化疗提高了卵巢癌患者的总体反应率，但随之而来的肿瘤细胞的耐药成为困扰临床治疗的主要障碍。因此了解卵巢癌细胞的发生、发展及耐药机制，有助于探索对卵巢癌治疗的新靶点，提高卵巢癌的生存率。中国网提供大量免费mba硕士，如有业务需求请咨询网站客服人员！

　　Lewis y 抗原是双岩藻糖基化的寡糖，可能参与许多细胞功能，包括粘附、识别和信号转导等，有利于肿瘤的侵袭和播散。 75%的上皮性卵巢癌出现Lewis y 不同程度的过量表达，且表达增加的患者预后不佳。我们利用建立的α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT) 基因及Lewis y 稳定高表达细胞模型，研究发现Lewis y 表达增加的同时，细胞的增殖、黏附等恶性生物学行为增强[4]，对5-FU、卡铂、紫杉醇等多种化疗药物的耐药性也明显增强，凋亡率明显下降[3,5]。 Lewis y 抗体可以抑制上述变化[6]。Klinger 等研究发现抗Lewis y 抗体IGN311 和ABL364 能抑制EGF 受体介导的信号转导通路，抑制Ras 的激活和MAPK 的磷酸化，促进肿瘤细胞的凋亡，表明Lewis y 与MAPK 信号转导通路家族的相关性，因此，我们推测Lewis y 可能通过p38MAPK 信号转导通路影响细胞的生存与凋亡，进而导致卵巢癌细胞的耐药。

　　本文探讨Lewis y 抗原与p38 丝裂原活化的蛋白激酶(p38mitogen-actived protein kinase，p38MAPK)信号途径的关系，探讨Lewis y 抗原致卵巢癌耐药的机制，为进一步阐明卵巢癌的耐药机制提供理论依据，为卵巢癌的临床治疗提供新的方法和途径。

　　2 材料

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2。1 卵巢癌细胞株细胞株RMG-I
源于卵巢透明细胞癌组织，RMG-I-H 细胞株为1,2-FT 及Lewis y 抗原高表达细胞系，由本实验室建立，方法如下：利用PCR 的方法克隆人1,2-FT 基因的编码区HFUT-H，构建表达载pcDNA3。1-HFUT-H，利用磷酸钙法将其转染入卵巢癌细胞系RMG-I，利用G418 筛选单克隆细胞，建立1,2-FT 基因稳定高表达细胞株RMG-I-H[4]。

　　2。2 主要试剂DMEM 和胎牛血清为美国Hyclone 公司产品；
胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠(EDTA)为美国Amresco 公司产品；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma 公司；Annexin Ⅴ-FITC 试剂盒为晶美生物工程有限公司产品；p-p38MAPK(phosph-p38MAPK)、p38MAPK 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specfic protease, caspase-3)抗体均购自美国Santa cruz 公司；抗Lewis y 单克隆抗体(clone A70-C/C8)购于英国Abcam 公司，在细胞培养液中的终浓度是10ug/ml，无交叉反应，该抗体适合做免疫组化。p38MAPK 特异性抑制剂SB203580 购自英国Promage 公司；RT-PCR 试剂购自日本TaKaRa 公司。ECL 发光试剂盒购自美国Pierce公司。

　　2。3 主要仪器流式细胞仪FACSCalibur 为美国Becton Dickinson 公司产品；
倒置荧光显微镜IX71 为日本OLYMPUS 公司产品；PCR 仪为日本TaKaRa 公司产品。

　　3 方法
3。1 细胞培养及制备细胞在含10%胎牛血清DMEM培养液中培养，0。25%胰蛋白酶及0。02%EDTA消化传代，取指数生长期细胞用于实验。

　　3。2 荧光染色法
取指数生长期细胞，接种于6 孔板，接种浓度保证细胞在同一时间生长至约占底面积1/3，行同步化处理。p38MAPK 抗体终浓度为2 ug/ml，p-p38MAPK 抗体终浓度为4 ug/ml，二抗浓度均为2 ug/m l，另设阴性对照组。弃上清，每孔加入4%多聚甲醛300 μl 室温20 min后加入封闭用羊血清工作液100 μl，37 ℃封闭30 min，加一抗50 μl 4 ℃过夜，避光加二抗30 μl，荧光倒置显微镜(×400)观察并照相。

　　3。3 RT-PCR 法