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一种新型的基因开关─RU486诱导调控系统

2015-02-22 01:08 毕业

随着基因治疗研究的不断深入，目的基因的精确表达已经成为首要问题。由于解决上述问题最好的方法就是拥有1系列复杂严密的基因调控系统，所以研究者们1直在寻求1种高效可靠的诱导调控体系，而RU486诱导调控系统就是目前找到的较好的1种。近10年来这1系统的研究已很广泛，它的结构也有几次大的改进，现就此予以综述。
1 RU486调控系统的结构
1 RU486调控系统的基本结构
RU486调控系统是1994年被Wang等[1]提出的，它由嵌合调控子反式作用调控区和目的基因区两部分组成。反式作用调控区含有任意启动子控制下的嵌合调控子（chimeric regulator, GLVP），后者是1种嵌合型的可诱导转录因子，它包括酵母转录因子Gal4的DNA结合区（Gal4DBD）、单纯疱疹病毒蛋白VP16激活区（VP16AD）和PR-891突变体改良后的C末端配体结合区（PRLBD-891）3部分。目的基因区是指在最小启动子（TATA盒或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子tk）和4个Gal4 DNA结合区串联体（p17×4）调控下的目的基因，如图1。
 

在GLVP中，Gal4DBD 代替了孕酮受体的DNA结合区，从而避免了任何激活内源性孕酮敏感性基因的可能，并且由于GAL4 DBD在哺乳动物细胞中不存在，目前也没有发现任何哺乳动物的靶基因可以被Gal4激活，所以这1调控子只会调控目的基因的表达，而不会影响任何内源基因[1]。PR-891是指野生型孕酮受体在891位点平头切断造成的突变体，因此其不能与孕酮受体激活剂R5020结合，但却可以与抗孕酮片RU486结合，从而在RU486存在时激活孕酮受体介导的基因。这可能是由于PR-891比野生型受体少42个氨基酸，而孕酮结合位点属于缺失的下游内，RU486结合区则位于上游位置[2]。这就避免了给予RU486时，激活内源性孕酮受体诱导其它基因引起1系列的细胞反应。并且由于反式作用调控子是1种嵌合型的可诱导转录因子，所以它不再与孕酮反应元件（PREs）或糖皮质类固醇应答成分（GREs）结合[3]，干预孕酮受体介导的转录，取而代之的是在RU486作用下，这1调控子仅仅与目的基因区的Gal4DBD结合，并激活目的基因转录表达[2]。由于PRLBD-891的转活能力较差，而VP16AD，即VP16的 C末端为酸性，可以直接与转录起始复合物中的转录因子TFIIB、TATA结合蛋白（TBP）和TBP辅助因子TAFII40相互作用，具有很强的转活功能。

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在目的基因区内，启动子有两种：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子（tk）和腺病毒E1b基因中仅仅包含TATA盒的最小启动子。Tsai[2]等使用氯霉素乙酰转移酶（CAT）作报告基因对2者进行比较发现，p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT转染时CAT基础活力明显要低1些；而给予RU486后，前者的CAT效能可达大约50倍，后者仅有10~15倍。这可能是由于tk启动子中含有GC和CAAT盒等序列，从而使转录效能较大。所以TATA盒启动子结构应用于要求目的基因的基础表达很低时，而在基础活力稍高能够耐受，要求转录效能很大时应使用tk启动子结构。对于p17x4，Gal4 DNA结合区的4个串联体则在这1系统中可以提供最大的转录效能。
2 RU486调控系统的结构改进
为了使RU486调控系统将来能够应用于人类的基因治疗，降低细胞毒性和免疫原性，Mark等[4]1999年使用NFκB家族成员――人的p65激活区（286~550）替代VP16激活区，构建出新的RU486反式作用调控区（GLP65），以减少VP16激活区可能带来的免疫反应。他们发现使用TATA盒启动子启动目的基因时，在没有RU486的情况下，GLP65的基础活力明显低于GLVP；给予RU486后两个调控子均表现出配体剂量依赖性的目的基因表达，这时GLVP组目的基因的表达更多，不过由于GLP65的基础值很低，所以RU486给予时，目的基因的表达倍数会更高。tk做目的基因启动子时，上述两种RU486系统则不管是否给予配体，两者的作用相当。所以在使用GLP65时，最好选用TATA盒启动子作为目的基因的启动子。
另外，Mark等[4]在反式调控区与目的基因区之间插入小鸡β-球蛋白5’端区域作为绝缘子（INS）将2者分隔，使目的基因在没有RU486的情况下不受调控系统的调节而产生表达。但是他们发现在活体大鼠模型，没有RU486表达，有无绝缘子都不会有目的基因的表达；但是HELA细胞水平上，不含绝缘子者的目的基因则会有较少的表达，而含绝缘子者没有。 （转载自科教范文网http://fw.nseac.com）
2 RU486调控系统的激活
RU486调控系统的激活过程与甾体类激素被其配体激活相似。反式作用调控子可以在不同的组织定向启动子作用下，在各自靶向的组织或细胞进行表达。当存在RU486时， RU486与PRLBD-891相结合，促使反式作用调控子发生构象变化形成2聚体而激活，激活的反式作用调控子与目的基因上游的Gal4 DNA结合区4聚体结合，从而启动目的基因的表达，如图2。反之，在没有RU486的情况下，由于反式作用调控子的构象不会发生变化，所以RU486调控系统不能被激活，即目的基因不能转录表达。这样，RU486调控系统便可根据RU486的量及给予时间，对目的基因的表达水平及其表达时程的长短进行控制[2]。
 
图2 RU486调控系统激活示意图
3 RU486调控系统的特点
1. 调控子的激活依赖于RU486的给予。在没有RU486的情况下，调控子所表达的蛋白没有毒性，也不传递表型，调控子不能激活目的基因的表达。只有给予RU486激活调控子后，目的基因才会表达蛋白。
2. RU486调控系统在转录水平调控目的基因的表达，所以可以直接控制后者的表达。
3. RU486给予量很小，仅仅能够激活调控子，并不能抑制内源性孕酮受体或糖皮质激素受体的功能。众所周知，RU486作为孕酮和糖皮质激素的拮抗剂时，它的浓度范围须达微克分子级，所以在临床使用中RU486作为流产药物的剂量应达600mg或10mg/kg。然而，在RU486调控系统中的RU486只需很少的浓度就可使目的基因表达。Wang等曾做RU486的浓度对照实验发现，当RU486浓度仅有0.1nmol/l时即可诱导目的基因的表达，并且系统达到最大活力时的浓度也仅须1nmol/l，这1剂量要比产生内源拮抗作用的浓度低1000倍[1]。
4. 调控过程是可逆的，且其使目的基因大量表达。RU486停药后目的基因表达停止，RU486的重复给予也会重复诱导目的基因的表达。
5. RU486调控系统非常适用于中枢神经系统的基因治疗。因为服用RU486后，其很容易通过血脑屏障，在临床中可以安全使用。
4 RU486调控系统的应用
1 RU486调控系统在单纯疱疹病毒载体（HSV）中的调控
Oligino[5]等将RU486系统引入无复制能力HSV载体中，lacZ为目的基因的目的基因区（p17x5-TATA-lacZ）插入HSV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶位点，反式作用调控区（VP-GL）置入同1载体的糖蛋白C位点，构建成HSV重组病毒GVHLZ。在病毒转染Vero细胞24h后，他们发现如果不给RU486，lacZ表达很低；若将细胞培养在含10-7mol/L的RU486基质中时，lacZ就会大量表达。并且，10－7mol/L的RU486即可使目的基因表达达最大。将GVHLZ注入SD大鼠海马后12和36h，给予RU486或生理盐水作对照，48h后处死大鼠取出海马进行检测，Oligino发现lacZ表达比对照组高达150倍。
2 RU486调控系统在腺病毒载体（Ad）中的调控
Magnus等[6]首次将RU486系统引入重组腺病毒载体中，CAT作为报告基因与p17x5-TATA结合插入Ad中形成AdG5TripCAT，反式作用调控区插入Ad形成Ad5dl309，将两者共转染HeLa细胞。他们在转染开始给予RU486后16h用ELISA法检测CAT的表达，发现CAT的表达随RU486给予量增加而逐渐增大，当RU486达4umol/l时CAT达最大。
2004年，钱程[7]等成功构建出RU486调控并携带IL12的第3代腺病毒，并将其进行了体外及体内的实验验证，发现RU486可以诱导和调控IL12的表达，这种诱导呈剂量依赖性变化，并且在调整RU486的给药间隔和重复给药，IL12的表达也会随其波动变化或维持在1定水平，RU486调控系统的基因开关作用表现完全。最近，Schillinger[8]等也将RU486诱导调控系统引入到高血压的基因治疗，将RU486调控系统控制的心房利尿肽（ANP）插入到第3代腺病毒载体中，从而实现了对ANP表达的剂量和时程控制。并且第3代腺病毒的超大容量、低免疫源性和低细胞毒性等优点使得这1系统更加完美。
3 RU486调控系统在果蝇中的调控
Gregg Roman[9]等利用RU486调控系统对转入果蝇的目的基因进行时间和空间的调控。他们将RU486调控系统插入到P{Switch}放大检测元件构成的质粒注入果蝇胚胎中，待果蝇4天大时给予RU486饮食。结果发现通过RU486基因开关可以对目的基因进行时序上的调控，在给予RU486饮食后1h即可得到非常高浓度的表达，3h后指示针可以检测到目的基因的活力。并且RU486的给予不会引起任何的不良反应，它不会增加果蝇的致死率，也不会影响果蝇的趋光性、趋地性和逃避反应等行为，仅有基因开关的诱导功能。Osterwalder[10]等则利用RU486调控系统对组织特异性的基因表达进行调控，发现在果蝇胚后期，RU486调控系统可以调控幼虫神经肌肉接头突触前后的转基因表达。
4 RU486调控系统在转基因动物中的调控
2005年Bo等[11]又将RU486诱导调控系统转入到转基因大鼠体内，通过控制RU486的给予观察转基因大鼠心内转基因的表达。他们使用心脏特异性α肌球蛋白重链（αMHC）启动子调控GLP65系统，将含有反式作用调控区的载体注射入FVB/N受精卵的前核得到αMHC-GLP65转基因大鼠，然后同样方法得到含人生长激素目的基因区（17X4-tk-hGH）的转基因大鼠，两者杂交得到双重转基因大鼠（αMHC-GLP65/Hgh），然后每天给大鼠腹腔内注射RU486（500ug/kg）观察。结果发现不给予RU486，hGH的表达始终处于很低的基础值；而随着RU486的不断给予转基因大鼠的hGH呈剂量依赖性表达，但在停药后7天内转基因表达即可降至基础水平；对于单转基因αMHC-GLP65大鼠，给予RU486后未发现任何表型出现。并且他们还首次报道，这1调控系统的作用对于任何年龄的大鼠都可适用。
5 其他的基因开关
目前基因开关的种类已经有很多，如4环素调控系统、甾体激素、免疫抑制剂、β-D-异丙基硫代半乳糖苷、FK1012细胞膜调控系统等等。虽然这些调控系统各自有各自的应用范围和优点，但是其中有些可能会激活其它的内源基因，如FK1012细胞膜调控系统，它是运用1种免疫抑制剂FK506的2聚体FK1012，通过激活细胞酪氨酸激酶途径来调控基因表达，因此由于细胞膜受体激酶级联反应干预多种内源基因的表达，所以这1系统无法调控特异的目的基因[2]。有些效力较低，或者在动物和人转基因运用中毒性较大（β-D-异丙基硫代半乳糖苷）。4环素调控系统则由于4环素在骨与其他组织的清除率较慢而引起关注。