冠心病痰瘀证与载脂蛋白E基因多态性关系的研究

关载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）作为脂蛋白的组成部分和功能蛋白，对血脂代谢起调节作用, 编码ApoE基因的变异是影响血浆胆固醇浓度的重要遗传因素之一。已有报道证实：不同遗传背景人群的ApoE的基因多态性通过影响脂质代谢而与冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病密切相关［1~3］。证候是中医认识和治疗疾病的根本，冠心病患者的临床表现以血瘀证和痰瘀互阻证为多见［4］。本研究对冠心病不同证候的发生和ApoE基因多态性的相关性进行了探讨，现报道如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  病例纳入标准  选择在北京西苑医院和北京东方医院就诊的心肌梗死患者、或经冠状动脉造影及介入治疗确诊为冠心病的患者，这些患者均符合1999年美国心脏病协会AHA/WHO公布的冠心病分型和诊断标准［5］。然后对这些患者进行中医辨证确定证候类型。痰证、血瘀证、痰瘀互阻证、气虚证、阳虚证、阴虚证、气滞证、寒凝证等参考国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语・证候部分》（国家标准GB/T16751.21997）。

　　1.2  病例排除标准  半年内曾有严重创伤或重大手术者；肾病综合征，甲状腺功能减退症，急性肝胆疾病及糖尿病患者；服用药物影响血脂代谢的患者；正在使用影响血脂代谢药物的患者。

　　1.3  病例资料  按上述标准纳入不同证候类型的冠心病患者共200例，其中男105例，女95例；平均年龄(63.6±5.8)岁；其中痰证20例（10%），瘀证79例（39.5%），痰瘀互阻证82例（41%），非痰非瘀证19例（9.5%）；身体质量指数（body mass index, BMI）为15.1～34.3 kg/m2。另选100名健康体检者作为对照组，其中男55名，女45名；平均年龄(62.1±7.8)岁；均无冠心病症状，常规心电图及超声心动图检查正常。以上样本人群均来自北京和河北地区，汉族，无血缘关系。所有病例均作标准基线问卷调查，结果记录于按临床流行病学要求设计的表格上。医师、患者和实验研究人员之间实行盲法。

　　1.4  材料

　　1.4.1  主要试剂  血清总胆固醇（total cholesterol, TC）和总甘油三酯（total triglycerides, TG）测定试剂盒购自法国申能公司；高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）测定试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供；血脂测定多项质控物由卫生部临床检验中心提供；全血DNA纯化试剂盒（Wizard genomic DNA purification kit）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量Marker（PCR Marker和pBR322Hae Ⅲ Marker）以及限制性内切酶HhaI均购自美国Promega公司；丙烯酰胺和NN’甲叉双丙烯酰胺，均购自北京鼎国生物技术公司。

　　1.4.2  血样采集  患者空腹12 h后，静脉抽取2 ml血样，乙二胺四乙酸抗凝，用于提取DNA。

　　1.4.3  引物  根据Richard 等［6］设计引物，序列为P1：5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’；P2：5’ ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’，均由北京鼎国生物技术公司合成。

　　1.5  方法

　　1.5.1  血脂水平的测定  测定TG采用胆固醇氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法；测定TC采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法（GPOPAP酶法）；测定HDLC采用选择性抑制法；测定LDLC采用选择性反应法。致动脉粥样硬化指数（atherogenic index, AI）的计算公式为：AI=（TC－HDLC）/HDLC。

　　1.5.2  ApoE基因型的测定  采用全血DNA纯化试剂盒提取全血DNA。按《现代心脏内科学》［5］中的条件扩增ApoE基因的目的片段。反应体系：10倍缓冲液2 μl，浓度为2 mmol/L的dNTPs 2 μl，二甲基亚砜2 μl，浓度为2 μmol/L的引物各0.25 μl，2 U Taq酶，DNA模板100～200 ng，总体积20 μl。循环条件：95 ℃预变性8 min，然后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35个循环后，72 ℃延伸8 min。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）检验扩增结果。取10 μl PCR产物加入10倍酶切缓冲液2 μl，小牛血清0.2 μl，浓度为10 U/μl的HhaI 0.5μl，去离子水7.3 μl。37 ℃反应4 h。产物用15% PAGE检测其基因型。

　　1.5.3  样品测序  随机选取各基因型的PCR产物送北京鼎国生物技术公司进行序列测定。