0 前言 X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质(2)
2013-06-11 01:06
导读：通过在不同温度下筛选结晶条件，结果在318K 下获得了衍射质量的晶体。研究发现，在最佳结晶温度下生长蛋白质晶体减少了蛋白质分子本身动态构象的微
通过在不同温度下筛选结晶条件，结果在318K 下获得了衍射质量的晶体。研究发现，在最佳结晶温度下生长蛋白质晶体减少了蛋白质分子本身动态构象的微观不均一性。GrpE 蛋白是DnaK 蛋白的辅酶，是一种促进蛋白质分子正确折叠的分子伴侣[10]。它是从一种最佳生长温度为338-345K 的嗜热菌中分离得到的，这种蛋白质必须在313K 进行热处理才能生长出晶体，如果不进行热处理就没有晶体出现。这是一个典型的温度诱导方法在蛋白质结晶中应用的例子。
Bartling 等人[27]研究了温度对去铁铁蛋白结晶的影响。研究发现，在三种镉浓度下，随着温度的增加最终导致了的晶体尺寸线性增加。在312.5K 下生长的去铁铁蛋白晶体最大。
在低的镉浓度下，温度的影响更显著。随着镉浓度的增加，去铁铁蛋白的溶解性对温度变得不敏感，这和溶菌酶一样。在高沉淀剂浓度下，蛋白质溶解度不依赖温度，而在较低沉淀剂浓度下，溶解度强烈依赖温度[21]。
即使晶体形成后，温度也会引起蛋白质构象的改变[28]。为了抵挡X 射线衍射源的辐射，晶体一般需要保持在低温状态下，低温可以增加晶体的分辨率，但也有可能引起蛋白质构象的改变。Dunlop 等人[28]对此进行了系统的研究：将同一种蛋白质晶体在三个室温和三个低温数据进行了比较。结果显示，虽然低温下可获得高分辨率的结构和更精确更细节的信息，但是它们系统地背离了室温结构，甚至在结构核心部分观察到显著的区别。这种变化在蛋白质表面更常见。这些区别会影响
生物学的解释，因为很多重要的生物过程发生在蛋白质表面。
因此，虽然在蛋白质结晶中可以获得高质量的低温数据，但是，室温数据仍是需要的，特别是当研究的蛋白质特性对温度的改变很敏感时。
（转载自http://zw.nseac.coM科教作文网）
1.3 最佳温度筛选装置用于蛋白质结晶
温度的细微改变可以显著影响蛋白质的溶解度。例如，温度变化0.5K 时，溶菌酶的溶解性就会变化很大，由于这个原因，一些蛋白质的结晶温度需要精确控制。Landsberg 等人发明了一种最佳温度筛选系统（Thermo-screen）[29]，该系统在一块192 孔坐滴板上设置温度梯度，温度范围277-372K，最大温度梯度20K，间隔精度0.3K。系统可以同时检测12个恒温点下，16 个不同的结晶条件。
应用该系统进行了蛋白质结晶实验。实验结果显示温度显著影响溶菌酶晶体的数量和尺寸。在低温（~279K），每孔有数百个小晶体。从恒温279K 增加到恒温292K，292K 下产生的晶体更少，晶体尺寸更大，质量更好。这和增加温度而致溶菌酶溶解度增加的结果一致。
在优化温度293K 和294.5K 之间，观察到每个孔有一些大的六角形晶体。再增加温度到303K导致晶体尺寸的减小，这可能是由于溶解度增加过大或蛋白质已经变性。
人类肾上腺素合成酶苯乙醇胺N -甲基蛋白(PNMT)的结晶实验结果相反。在较低温度（~279K）下，观察到较少的晶体。随着温度的增加晶体数量减少，这和温度与溶解度的关系相一致。在282.5-285.2K 之间，晶体数量更少，晶体尺寸更大（大至0.15mm）。然而，随着温度的再次增加，晶体尺寸减小，数量增加，直至293K，只能观察到大量的小晶体。
这些结果显示，优化温度在283K 左右，PNMT 晶体形貌最好。而这个温度和大家先前用于PNMT 结晶的温度（293K）不同。运用该系统得到过氧化氢酶的优化温度为~293 K。
1.4 筛选最佳温度方法用于蛋白质结晶筛选
Lin 等人[18,30]研究了不同温度下蛋白质的相图，比较了它们的形核区，发现温度改变了形核区的大小，增加了蛋白质的可结晶性。例如，当温度从295K 变为277K 时，RibonucleaseS 和 Trypsin 的形核区面积分别增加2.4 和1.6 倍，同时结晶成功率分别从20.8%增加到42.9%，从12.5%增加到25%。Chymotrypsinogen A 和 Concanavalin A 的形核区增加到1.6和1.7 倍（温度从277K 变为295K），结晶成功率分别从37.5%增加到54.2%，从43.3%增加到73.4%。因此，筛选最佳温度进行结晶，可以显著提高蛋白质的结晶成功率。一种新的Epididymal-specific Lipocalin 蛋白质，通过筛选最佳温度，很快获得了第一个晶体，且晶体分辨率达1.97?。因此，用不同的温度，可以筛选到一些新的结晶条件。
