0 前言 X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质(4)
2013-06-11 01:06
导读：相较而言，在快速冷却条件下，晶体在较低温度（高过饱和度）下形核，晶体数量更多。这些结果显示在较慢的冷却速度下，蛋白质结晶过程变慢，生长了
相较而言，在快速冷却条件下，晶体在较低温度（高过饱和度）下形核，晶体数量更多。这些结果显示在较慢的冷却速度下，蛋白质结晶过程变慢，生长了高质量的溶菌酶晶体。
2.1.3 变温保持恒定过饱和度方法生长高质量晶体
如果想优化生长大的适合X 射线衍射的蛋白质晶体，有必要在结晶过程中控制恒定过饱和度水平从而保持晶体的生长速率不变，这种方法叫做恒量过饱和度方法[37]（CSC：
constant supersaturation control）。该方法可通过控制温度而使蛋白质溶液在亚稳区保持恒定的过饱和度来优化晶体的继续生长但不再形成核子。
Schall 等人在CSC 运算中，用文献[38]中测得的ΔHxtal 及生长速度参数（k，n），文献[39-41]
中溶解度数据（C*），计算出温度的变化。CSC 程序中温度变化范围为293K 到277K。该程序可以从一个较低的过饱和度开始，控制晶体生长速度为一个恒值。应用CSC 程序控制，在NaCl 溶液中溶菌酶晶体的生长速度恒为7?/s。在较低的蛋白质过饱和度下，生长速度为1-3 ? /s。Schall 等人用该方法生长了高质量的四角形溶菌酶晶体。
这项技术需要蛋白质的溶解度对温度很敏感，然而并非所有的蛋白质都如此。这时，可以通过改变结晶溶液的成分来增加温度对蛋白质的敏感性。选择电解液类型和浓度是增加蛋白质溶解度对温度敏感的关键因素。一般来说，蛋白质的溶解性在低盐浓度下对温度的变化更敏感。一种简单的测量蛋白质是否对温度敏感的方法是通过直接测量结晶的焓变（ΔHxtal）[42]。ΔHxtal 值大则意味着溶解度对温度敏感。增加温度敏感性的优势是通过温度的微小改变使过饱和度从相图中的形核区迅速移向亚稳区。在NaCl 溶液中，当NaCl 浓度从1.25M 减少到0.75M 时，溶菌酶的ΔHxtal 增加3.8 kcal/mol（从10.7±0.9 到14.5±1.7 kcal/mol）。在NaNO3 溶液中，当NaNO3 浓度从0.4M 变化到0.2M 时，ΔHxtal 增加了5.7 kcal/mol （从9.7±0.6到15.4±1.4 kcal/mol）。在NaSCN 溶液中，当NaSCN 浓度从0.12M 减小到0.1M 时，ΔHxtal增加了0.9 kcal/mol（17.5±0.8–18.4±1.0 kcal/mol）。这说明可以改变结晶溶液的成分来增加温度对蛋白质的敏感性，从而通过调节温度改变蛋白质溶解度。此外，在NaCl 中加入NaSCN和NaNO3 低离子强度的盐，增加了蛋白质结晶对温度的敏感性。
内容来自www.nseac.com
将NaCl 替换为NaNO3 和NaSCN，这些盐溶液条件在恒温下生长的晶体衍射质量差，当调用CSC 温度程序控制后晶体更大，X 射线衍射数据显示几乎没有缺陷[42]，分辨率为1.62?。此外，在CSC 温度程序下生长的晶体抗辐射损伤能力增强，在连续曝光下，可衍射长达45 个小时。但是，这种方法的局限性是需要大多数蛋白质的
物理化学数据。
2.2 变温提高结晶筛选成功率
与恒温相比，在一个合理范围内变化温度可以增加结晶筛选的成功率。Zhang 等人[17]
采用温度循环策略（CTS: Cycling Temperature Strategy）研究了蛋白质结晶筛选成功率。变温程序如（a）所示[17]。首先温度用t1 时间从T1 线性增加到T2，然后用t2-t1 时间从T2线性减小到T1。在这项研究中，温度增加和降低的速度相等，t2=2t1。其中T1=277K，T2=303K，t2=48h。对照实验中恒温为277 K。
（b）[17]显示了多种蛋白质在CTS 程序下结晶条件筛选成功率得到提高的结果。当蛋白质适合的结晶温度未知时，CTS 程序可用于提高结晶筛选的成功率。
3 结束语
生长高质量蛋白质晶体一直是结构生物学领域的瓶颈问题之一。在众多影响蛋白质结晶的因素中，温度控制是至关重要的，但一直以来没有受到广泛重视。本文总结了恒温（最佳结晶温度）和变温对蛋白质结晶的影响。由于蛋白质的特异性，每种蛋白质的最佳结晶温度有很大差异，有必要对温度进行筛选，这既有利于寻找到结晶条件，也有利于生长高质量蛋白质晶体。而变温既可以用于生长高质量蛋白质晶体，当蛋白质的结晶温度未知时，在蛋白质结晶筛选过程中，变温也可以用来寻找结晶条件。因此，通过适当的温度控制，可以显著提高蛋白质结晶筛选成功率及蛋白质晶体质量。可见，在蛋白质结晶过程中，对温度的控制是不容忽视的。
