0 前言 X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质(3)
2013-06-11 01:06
导读：2 变温应用于蛋白质结晶的研究 变温方法主要用于生长高质量的蛋白质晶体，同时也应用于提高蛋白质结晶筛选的成功率。在提高蛋白质晶体质量方面，通
2 变温应用于蛋白质结晶的研究
变温方法主要用于生长高质量的蛋白质晶体，同时也应用于提高蛋白质结晶筛选的成功率。在提高蛋白质晶体质量方面，通过改变温度控制溶解度的改变，从而优化晶体生长速度，生长高质量的蛋白质晶体。在蛋白质结晶筛选时，通常事先无法确定最佳结晶温度，通过温度扫描方法可以覆盖更多可能结晶的温度点，从而获得更多的蛋白质结晶条件。
2.1 变温提高蛋白质晶体质量
2.1.1 温度扫描生长高质量蛋白质晶体
温度对蛋白质的溶解度有显著的影响。有些蛋白质的溶解度随温度增加而增大，如溶菌酶；而有些蛋白质的溶解度随温度增加而减小，如糜蛋白酶原A[31]。溶解度作为温度的函数可用Van't Hoff 公式进行表示[32]：
式中：ΔHxtal 是形成蛋白质晶体时的焓变，kJ/mol；B 是熵变的参数；R 是摩尔气体常数；C*是蛋白的溶解度，mg/ml；T 是相平衡时的绝对温度。由上式可知，当ΔHxtal 为正值时，蛋白质的溶解度随温度增加而增大；当ΔHxtal 为负值时，蛋白质的溶解度随温度增加而减小。一般认为，结晶时较大的焓值对应着晶体较大的表面能[33]。我们从一些文章中总结比较了ΔHxtal 的值，发现溶菌酶的ΔHxtal 是负值，这意味着溶菌酶结晶过程是放热过程，因此溶菌酶的溶解度随温度增加而增大。而糜蛋白酶原A 的ΔHxtal 是正值，意味着糜蛋白酶原A 结晶过程是一个吸热过程，因此糜蛋白酶原A 的溶解度随温度增加而减小。
Lu 等人[31]比较了溶菌酶在恒温（277K，305K）和逐渐增加温度程序（277K-305K，3K/天）对蛋白质结晶的影响，糜蛋白酶原A 在恒温（277K，305K）和逐渐减少温度程序（305K-277K，3K/天）对蛋白质结晶的影响。研究发现温度扫描（扫温）对溶菌酶的晶型影响很大，而对糜蛋白酶原A 的晶型影响很小。溶菌酶晶体在恒温305K 时，形貌为拉长状；在恒温277K 时，形貌变的更短、更厚。在扫温实验中，两种形貌都有。另外，恒温277K时与其他程序相比，晶体形貌缺陷更多（裂纹，应力碎片和深的裂口）。这是由于低温时，高的过饱和度驱动晶体生长速度过高而导致晶体缺陷和杂质的合并。温度扫描保持一个稳定的晶体生长速度，生长出了更高质量的晶体[31]。
（科教范文网http://fw.NSEAC.com编辑发布） Budayova 等人设计了一个变温装置[34]，利用相图的知识，加入籽晶后，控制温度保持晶体在结晶溶液的亚稳区，以较低的晶体生长速度缓慢生长高质量蛋白质晶体。了解相图中蛋白质溶解度和温度的关系有利于控制温度生长高质量蛋白质晶体。所示为温度随蛋白质浓度变化的相图示意图。在亚稳区形核不再产生，籽晶以较缓慢的速度生长。该方法利用亚稳区的特点缓慢改变温度，保持晶体在亚稳区缓慢生长。此变温装置生长了高质量的human γ-crystallin E, PA-IIL lectin, yeast inorganic pyropHospHatase, urate oxidase 和 humancarbonic anhydrase II 晶体。
2.1.2 优化冷却速度方法生长高质量晶体
溶液过饱和度的控制对生长高质量蛋白质晶体很重要。实验中可以通过温度来控制溶液的过饱和度，冷却方法是生长大的高质量晶体的重要策略。然而，很少有人研究冷却速度对结晶过程的影响，主要是因为没有便利的工具优化蛋白质结晶的冷却速度。为了寻找理想的条件，研究者必须准备一些不同的温度控制工具，利用不同的冷却速度进行结晶实验的对比。
Adachi 等人[35]发明了一种新的温度控制工具——即时控制温度（TAON）法，它可以在一个结晶板上通过产生温度梯度来设定多个温度点。后来他们对此装置又进行了改进，在TAON上增加电脑控制多个冷却速度[36]。改进的TAON 能够同时在一块结晶板上控制多个冷却速度来生长蛋白质晶体，从而更有效优化了蛋白质晶体生长。
该实验首先将溶菌酶结晶溶液在恒温293K 让其自然形核，没有晶体出现。然后改变结晶溶液温度，冷却速度为1.5–4.0K/天，自动设定最终结晶温度为283K。同时用控温箱快速冷却样品从293K 到283K 作为对照。比较HEWL 的结晶结果发现，在较慢的冷却速度下，晶体数量明显减少。这主要是由于较慢的冷却条件下，形核发生在较高温度（较低过饱和度）。
